Chẩn đoán
Gánh nặng chính của bệnh sốt rét ở các vùng lưu hành là do nhiễm P. falciparum, mặc dù P. vivax cũng đóng góp đáng kể ở khu vực Đông Nam Á và Nam Mỹ. Tuy nhiên, việc chẩn đoán nhầm các trường hợp nhiễm không phải P. falciparum bằng kính hiển vi quang học cũng góp phần vào số lượng ca bệnh P. falciparum tại các vùng lưu hành. Các nguyên nhân góp phần bao gồm việc các kỹ thuật viên kính hiển vi thiếu kinh nghiệm không phân biệt được các loài Plasmodium, thiếu kính hiển vi chất lượng cao, các trường hợp nhiễm Plasmodium không triệu chứng và mật độ thấp, cũng như xu hướng của ký sinh trùng P. malariae là duy trì ở mức độ khó phát hiện, đặc biệt là ở các giai đoạn sớm, khiến kính hiển vi quang học không thể phát hiện được.
P. malariae thường cùng tồn tại với các loài Plasmodium khác tại các vùng lưu hành, đặc biệt là P. falciparum và do đó nó thường bị chẩn đoán nhầm trong các trường hợp nhiễm phối hợp hoặc nhiễm không triệu chứng. Hơn nữa, các xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDT) không hiệu quả, cho thấy sự biến thiên cực độ về độ nhạy (dương tính thật) và độ đặc hiệu (âm tính thật) trong việc phát hiện các trường hợp đơn nhiễm P. malariae (Bảng 1).
Sự biến thiên trong việc phát hiện các ca bệnh P. malariae dương tính thật và âm tính thật hoặc sốt rét không phải P. falciparum thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loại RDT được sử dụng để chẩn đoán. Các nghiên cứu tổng quan hệ thống và phân tích gộp về khả năng chẩn đoán của RDT trong việc phát hiện P. malariae hoặc các trường hợp nhiễm không phải P. falciparum cho thấy RDT Loại 2 (P. falciparum-histidine rich protein-2 (HRP2) + Pan-aldolase) có thể phát hiện gần 80% các trường hợp đơn nhiễm P. malariae được xác nhận bằng PCR hoặc sốt rét không phải P. falciparum. Tương tự, các loại RDT khác như RDT Loại 3 (P. falciparum-HRP2 + pan-Plasmodium lactate dehydrogenase (pLDH)), RDT Loại 4 (P. falciparum-LDH + pan-pLDH) và RDT Loại 6 (P. falciparum-HRP2 + P.v.-pLDH + pan-pLDH) cũng cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu biến thiên, với hiệu suất kém ( độ nhạy: 32-67%) được ghi nhận ở RDT Loại 6 trong việc phát hiện đơn nhiễm P. malariae (Bảng 1).
Tất cả những yếu tố này góp phần vào việc đánh giá thấp tỷ lệ nhiễm P. malariae. Do đó, cần sử dụng kính hiển vi chất lượng tốt hơn do nhân viên đã qua đào tạo vận hành nhằm chẩn đoán chính xác tất cả các loài ký sinh trùng sốt rét ở người (đặc biệt là P. malariae và P. ovale), cho đến khi các công cụ phân tử tại chỗ được triển khai để đạt được mục tiêu loại trừ sốt rét.
Bảng 1. Phương pháp chẩn đoán được sử dụng để phát hiện nhiễm Plasmodium malariae
| Phương pháp chẩn đoán | Loài mục tiêu | Độ nhạy/Ngưỡng phát hiện (LOD)* | Độ đặc hiệu | Những hạn chế chính | Tài liệu tham khảo |
| Xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDT) |
| RDT Loại 2 (P.f.-HRP2+ Pan-aldolase) so với PCR | P.m. | 0-80% (biến thiên rất cao) | 42-99% (Biến thiên cao) | Số lượng ít các trường hợp đơn nhiễm P. malaria được đánh giá (trung vị 5 ca mỗi nghiên cứu); sức mạnh thống kê thấp do loại hình nghiên cứu phân tích tổng hợp; tiêu chuẩn tham chiếu thay đổi (chủ yếu là PCR và một vài nghiên cứu là hiển vi). | 37 |
| RDT Loại 3 (P.f.-HRP2+ pan-pLDH) so với kính hiển vi | P.m./nhiễm phối hợp Plasmodium hoặc các loài không phải falciparum | 14-100% (biến thiên cao) | 65-100% | Thiếu dữ liệu đặc hiệu cho P.m., thay vào đó chẩn đoán được báo cáo cho sốt rét không phải falciparum trong bài đánh giá Cochrane; sự không đồng nhất giữa các loại nghiên cứu và các phương pháp tham chiếu được sử dụng trong các nghiên cứu được chọn trong phân tích tổng hợp. | 37, 38 |
| RDT Loại 4 (P.f.-LDH + pan-pLDH) so với kính hiển vi | P.m./không phải falciparum | 0-100% (biến thiên cao) | 72-91% | Không thể phân biệt P.m. với P.o.; Thiết kế nghiên cứu không rõ ràng trong nhiều nghiên cứu; số lượng ca bệnh P.m. nhỏ hơn trong các nghiên cứu được chọn. | 37, 38 |
| RDT Loại 6 (P.f.-HRP2 + P.v.-pLDH + pan-pLDH) so với kính hiển vi | P.m. | 32-67% | 99% | Số lượng nghiên cứu được đưa vào cực kỳ ít; các nhãn hiệu khác nhau được sử dụng để đánh giá RDT. | 37 |
| Kính hiển vi quang học |
| Kính hiển vi so với nested PCR | P.m. | Bỏ lỡ ~71% các trường hợp dương tính với PCR (cực kỳ thấp) | Không được báo cáo | Số lượng mẫu ít; Kính hiển vi được phát hiện là cực kỳ không nhạy để phát hiện các trường hợp P.m. không triệu chứng. | 39 |
| Các phương pháp chẩn đoán phân tử |
| qPCR thời gian thực tối ưu hóa so với kính hiển vi | P.m. | 95%; LOD: 0,32 ký sinh trùng/µl (độ nhạy phân tích) | 95%; Tuyệt vời (không có phản ứng chéo với các loài khác) | Không thể phát hiện các trường hợp nhiễm phối hợp Plasmodium vì P.m. thường hiện diện trong các trường hợp nhiễm phối hợp. | 57 |
| CRISPR-SHERLOCK | P.m.; P.f.; P.v.; P.o.; P.k. | 94% đối với P.f.; Không được báo cáo đối với các loài không phải falciparum | 94% đối với P.f.; Không được báo cáo đối với các loài không phải falciparum | Sử dụng ký sinh trùng nuôi cấy và không phải mẫu thu thập tại thực địa hoặc mẫu lâm sàng đa dạng; thiết kế CRISPR-RNA có thể không tính đến tất cả các biến thể đang lưu hành của các loài không phải falciparum. | 49 |
| Các mồi hợp tác (Cooperative primers) | P.m. | Độ nhạy phân tích tăng gấp 10 lần so với các mồi thông thường | Không được báo cáo | Không có xác nhận lâm sàng; Thiếu tiêu chuẩn chẩn đoán, tức là không có sự so sánh với các xét nghiệm tiêu chuẩn vàng. | 53 |
| Các phương pháp phân tử - Có thể triển khai tại thực địa |
| Xét nghiệm dòng chảy bên khuếch đại đẳng nhiệt nhanh so với qPCR | P.m. | 95% | 88% | Dương tính giả trong một mẫu P.v.; diễn giải bằng mắt thường của dòng chảy bên (vạch mờ trong các bối cảnh lưu hành thấp) có thể tạo ra sai số. | 54 |
| CRISPR-SHERLOCK siêu nhạy | P.m.; P.f.; P.v.; P.o. | 100% cho P.f. và P.v.; LOD: 0,36-2,4 ký sinh trùng/µL cho P.f. và P.v., nhưng đối với P.m. là 1,9 ký sinh trùng/µL | 100% cho P.f. và P.v.; LOD: 0,36-2,4 ký sinh trùng/µL, bao gồm cả P.m. ở mức 1,9 ký sinh trùng/µL | Cỡ mẫu rất thấp; Không có kiểm tra hiệu suất lâm sàng trên các mẫu P.m. | 50 |
| Khuếch đại hỗ trợ bởi recombinase với xét nghiệm que thử dòng chảy bên | P.f.; P.v.; P.m.; P.o. | 100 pg/µl - Độ nhạy phân tích (LOD) cho P.m. | Không được báo cáo | Ít nhạy hơn đối với P.m. so với P.f. (0,1 pg/µl); không tốt trong các bối cảnh mật độ ký sinh trùng thấp. | 55 |
| Thiết bị LAMP vi lưu dựa trên giấy | P.f.; có thể cả các loài khác | 98% | Cao như được thấy qua so sánh với chuẩn vàng, nhưng không được nêu rõ ràng | Dữ liệu đặc hiệu cho loài Plasmodium không được hiển thị; không rõ ràng về tính mạnh mẽ của chẩn đoán P.m. | 56 |
| Xét nghiệm miễn dịch |
| Các protein tái tổ hợp của protein bề mặt 1 của ký sinh trùng non của P.m. (P.m.-MSP1) | P.m. | Không được báo cáo | Phản ứng mạnh với huyết thanh kháng P.m. ở người; không phản ứng với huyết thanh P.f./P.v. | Cỡ mẫu nhỏ; tính sinh miễn dịch được thử nghiệm trên mô hình chuột; không kiểm tra hiệu suất chẩn đoán trên các mẫu/nhóm bệnh nhân lâm sàng; thử nghiệm phản ứng chéo hạn chế (đã thử nghiệm cho P.f. & P.v.). | 51 |
| Xét nghiệm miễn dịch sốt rét 5-plex so với PCR | P.m. | 96,2-100% | 96,1-97,1% so với các nhóm chứng âm tính với sốt rét | Phản ứng chéo đáng kể của P.f.-LDH trong các trường hợp nhiễm P.m. với độ đặc hiệu là 3,9%. | 44 |
| Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết aptamer (ALISA) | P.v. | 96% | 100% | Không tồn tại thử nghiệm dựa trên aptamer cho P.m.; thiếu dữ liệu. | 46 |
| Xét nghiệm dựa trên hạt bắt giữ enzyme liên kết aptamer | P.f. | 90% | Không được báo cáo | Không tồn tại thử nghiệm dựa trên aptamer cho P.m.; thiếu dữ liệu. | 47 |
P.m: Plasmodium malariae; P.f: Plasmodium falciparum, P.v: Plasmodium vivax, P.o: Plasmodium ovale, P.k: Plasmodium knowlesi, HRP2 histidine rich protein-2, PCR: polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi polymerase, pLDH: Plasmodium lactate dehydrogenase, qPCR: quantitative real-time PCR - PCR định lượng thời gian thực, LAMP: loop-mediated isothermal amplification - khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp, CRISPR-SHERLOCK: clustered regularly interspaced short palindromic repeats-specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking.- Công cụ báo cáo thực thi bằng enzyme độ nhạy cao đặc hiệu lặp lại palindromic ngắn xen kẽ đều đặn * Limit of detection - Giới hạn phát hiện (LOD).
Những tiến bộ gần đây trong các xét nghiệm phân tử hoặc enzyme đã dẫn đến việc chẩn đoán tốt hơn các trường hợp nhiễm P. malariae (Bảng 1). Các báo cáo cho thấy tỷ lệ nhiễm P. malariae âm tính khi soi kính hiển vi nhưng dương tính với PCR dao động trong khoảng 12-71% tại khu vực các quốc gia Nam bán cầu. Lo và cộng sự báo cáo rằng 71% (32/45) mẫu dương tính với P. malariae (đơn nhiễm) được phát hiện bằng PCR đã bị bỏ sót khi soi kính hiển vi ở Kenya. Tương tự, tại vùng Yaoundé của Cameroon, đơn nhiễm P. malariae ở những cá thể không triệu chứng vẫn không được phát hiện qua kiểm tra lam máu dưới kính hiển vi, trong khi chẩn đoán dựa trên PCR cho thấy tỷ lệ nhiễm là 12%.
Một khu vực khác của Cameroon, Vùng Adamawa, đã báo cáo 17% trường hợp nhiễm phối hợp P. falciparum + P. malariae được xác nhận bằng PCR với tỷ lệ nhiễm thoa trùng là 8,4%, nhấn mạnh đóng góp đáng kể của P. malariae, bên cạnh P. falciparum, vào tỷ lệ truyền bệnh sốt rét duy trì ở mức cao trong vùng. Một đợt bùng phát P. malariae gần đây với tỷ lệ dương tính gần 46% đã được ghi nhận tại Việt Nam. Tất cả trường hợp P. malariae đều dương tính khi soi kính hiển vi và PCR, nhưng lại âm tính với RDT. Gần 90% mẫu dương tính với P. malariae trong đợt bùng phát này có sự hiện diện của giao bào với mật độ trung vị là 52 ký sinh trùng trên mỗi microlite máu, gợi ý khả năng truyền bệnh cao.
Bằng chứng về sự phơi nhiễm rộng rãi của con người với P. malariae được chứng minh qua việc phát hiện loài này với tần suất cao (~44% dương tính PCR) tại vùng Amazon thuộc Colombia, trái ngược với tỷ lệ phát hiện thấp hơn nhiều dọc biên giới Trung Quốc–Myanmar (dưới 1%). Tỷ lệ lưu hành 1,3% đã được xác định thông qua phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (restriction fragment length polymorphism–denaturing high-performance liquid chromatography hay RFLP-DHPLC) tại Campuchia, nơi mà soi kính hiển vi đã thất bại trong việc phát hiện bất kỳ trường hợp P. malariae nào. Một số quốc gia Đông Nam Á khác báo cáo tỷ lệ lưu hành không đồng nhất của P. malariae, dao động từ mức thấp nhất là một trường hợp soi kính hiển vi tại tỉnh Bắc Sumatra, Indonesia đến 37% (47/127) lam máu dương tính với P. malariae tại tỉnh Nam Sumatra, Indonesia. Bang Odisha của Ấn Độ, nơi đóng góp gần 40% tổng số ca sốt rét của cả nước, cho thấy tỷ lệ dương tính với P. malariae đáng kể, khoảng 9-10% khi sử dụng PCR. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi chỉ quan sát thấy một số lượng ít ỏi các trường hợp P. malariae qua soi kính hiển vi tại một bang vùng Đông Bắc Ấn Độ và các trường hợp này đều cho kết quả âm tính với RDT.
Hiện có rất ít thông tin về động thái của việc biệt hóa giao bào và sự truyền bệnh của P. malariae, nhưng các nghiên cứu gợi ý rằng nhiễm phối hợp P. malariae có tác động đến mật độ giao bào của P. falciparum. Ngày càng rõ ràng rằng P. malariae có lợi thế từ việc nhiễm phối hợp với các loài Plasmodium khác, thể hiện qua sự gia tăng mạnh mẽ mật độ cả giai đoạn vô tính và giao bào trong những trường hợp này. Điều này làm nổi bật tác động rõ rệt của nhiễm phối hợp đối với sự tăng sinh sinh học của P. malariae, nơi nó không chỉ cùng phát triển mà đôi khi còn cạnh tranh vượt trội các loài đồng nhiễm. Một ngoại lệ cho những quan sát này là một nghiên cứu báo cáo sự sụt giảm các dạng vô tính và giao bào của P. malariae khi có sự hiện diện của nhiễm phối hợp P. falciparum, liên kết hiệu ứng ức chế này đối với P. malariae với sự tiến triển của bệnh nặng. Do đó, các nghiên cứu trong tương lai liên quan đến vai trò của miễn dịch vật chủ, sinh thái hồng cầu và đa dạng di truyền của ký sinh trùng sẽ rất cần thiết để giải thích sự ức chế hoặc lợi thế của P. malariae trong các trường hợp nhiễm phối hợp. Tuy nhiên, việc loại trừ hoặc giảm đáng kể các trường hợp nhiễm P. falciparum (ví dụ, thông qua các nỗ lực phát triển vaccine gần đây) có thể dẫn đến tình trạng tăng nặng mật độ ký sinh trùng P. malariae và nhiễm sốt rét ác tính, vốn bình thường vẫn duy trì ở mức độ thầm lặng. Tất cả bằng chứng này cho thấy loài P. malariae phổ biến hơn nhiều so với suy nghĩ trước đây.
Mặc dù vậy, các công cụ chẩn đoán sắp ra mắt đã chứng minh khả năng phân biệt nhiễm P. falciparum với nhiễm P. malariae/ P. ovale. Các RDT mới hơn này dựa trên tỷ lệ pan-pLDH so với P. falciparum-LDH bằng phương pháp miễn dịch sốt rét và đặc biệt hữu ích ở các khu vực có đột biến mất đoạn gen P. falciparum-HRP244. Do sự bảo tồn đáng kể của pLDH trên tất cả loài Plasmodium chính gây bệnh ở người (độ tương đồng cao hơn 90%), đây là một mục tiêu tiềm năng để phát hiện sốt rét bằng các phương pháp chẩn đoán dựa trên aptamer. Tuy nhiên, đến nay phương pháp này chỉ giới hạn trong chẩn đoán P. falciparum và P. vivax. Một nghiên cứu giám sát huyết thanh học quy mô lớn đã phát hiện sự hiện diện của kháng thể immunoglobulin-G chống lại kháng nguyên protein 1 bề mặt ký sinh trùng non P. malariae (PmMSP1) ở 278 trên tổng số 21.719 trẻ em trong độ tuổi đi học. Tỷ lệ dương tính huyết thanh ở trẻ em từ 6 đến 7 tuổi cho thấy sự phơi nhiễm với mầm bệnh tại khu vực này đã xảy ra thường xuyên, vì kết quả dương tính huyết thanh như vậy chỉ có thể do nhiễm bệnh tự nhiên.
Bên cạnh các phương pháp chẩn đoán nêu trên, một số công cụ tiên tiến mới hứa hẹn cải thiện việc chẩn đoán và giám sát P. malariae. Những công cụ này bao gồm nền tảng phát hiện axit nucleic dựa trên CRISPR mang tên SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking), PmMSP1 tái tổ hợp, kháng nguyên màng đỉnh-1 (AMA1) tái tổ hợp và RT-PCR dựa trên mồi hợp tác. Gần đây, nhiều loại xét nghiệm có thể triển khai tại thực địa đã được phát triển dựa trên CRISPR, khuếch đại hỗ trợ bởi tái tổ hợp, LAMP, … Một số trong số này sử dụng phương pháp khuếch đại trùng hợp tái tổ hợp đẳng nhiệt (recombinase polymerase amplification - RPA) nhanh và phát hiện bằng dòng chảy bên để phát hiện P. malariae với giới hạn phát hiện tốt hơn khoảng 10-100 lần so với các xét nghiệm pLDH hiện có, với độ nhạy phân tích là 100 pg trên mỗi microlit máu nhiễm P. malariae.
Các phương pháp này kết hợp các thiết bị phân tích vi lưu dựa trên giấy với các mồi và đầu dò đặc hiệu chống lại 18S RNA ribosom của Plasmodium spp. và một hệ thống RPA tích hợp trên chất nền giấy để phát hiện các loài Plasmodium ở mức thấp tới 0,028 ký sinh trùng trên mỗi microlit máu. Ngoài ra, một phương pháp RT-PCR tối ưu, tiết kiệm chi phí đã được báo cáo là có thể phát hiện mức thấp tới 0,32 ký sinh trùng P. malariae trên mỗi microlit máu. Các phương pháp chẩn đoán nêu trên với độ chính xác và những hạn chế khác nhau trong việc phát hiện nhiễm P. malariae được tóm tắt trong Bảng 1. Những giải pháp kỹ thuật mới này có tầm quan trọng tối ưu nhằm cải thiện việc phát hiện nhiễm P. malariae và hỗ trợ các nỗ lực giám sát cũng như loại trừ sốt rét chính xác hơn.
(Còn nữa) ---> Tiếp theo Phần 3
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang & CN. Nguyễn Thái Hoàng
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn