Một số giải thích cho sự khác biệt
Phát hiện cho thấy các loài vượn hoang dã ở trung tâm Châu Phi bị nhiễm trùng lan rộng với nhiều chủng P. vivax khác nhau và mang một loài Plasmodium spp. riêng biệt nhưng có liên quan, điều này cung cấp cái nhìn sâu sắc mới về lịch sử tiến hóa của P. vivax ở người và có khả năng giải quyết nghịch lý rằng một đột biến mang lại khả năng kháng P. vivax xảy ra với tần suất cao ở chính khu vực mà ký sinh trùng này không hiện diện. Những kết quả này cho thấy P. vivax ở người bắt nguồn từ một loài Plasmodium spp. lây nhiễm cho tinh tinh và khỉ đột và cho thấy nguồn gốc ở châu Phi chứ không phải ở châu Á như giả định trước đây. Một cách giải thích về cây phát sinh chủng loài là một sự chuyển đổi vật chủ duy nhất từ vượn đã tạo ra P. vivax ở người, tương tự nguồn gốc của P. falciparum ở người. Tuy nhiên, điều này dường như không khả thi trong trường hợp này vì P. vivax ở vượn không phân chia thành các dòng dõi đặc trưng của khỉ đột và tinh tinh và vì con người dễ bị nhiễm cả P. vivax tự nhiên và nhiễm P. vivax thực nghiệm 27 ở vượn.
Hình 5. Các thách thức liên quan đến sự hiểu biết P. vivax và tiệt trừ bao gồm: (a) Một sự thiếu đi công cụ chẩn đoán thể ngủ, phân biệt P. vivax với các loài Plasmodium spp. khác, thiếu đi phương pháp và kỹ thuật làm sao nuôi cấy liên tục in vitro và thiếu sự hình thành tiêu chuẩn đánh giá mức độ nghiêm trọng của P. vivax; (b) P. falciparum bao gồm tính đa hình trong các gen đặc biệt dẫn đến kháng thuốc, Đột biến mất đoạn HRP2/3 trên quần thể ở khắp nới trên toàn cầu |Nguồn: https://smart.servier.com (accessed on 20 March 2021).
Do đó, một cách giải thích hợp lý hơn là một dòng P. vivax tổ tiên đã có khả năng lây nhiễm cho con người, khỉ đột và tinh tinh ở Châu Phi cho đến khi đột biến Duffy âm tính bắt đầu lan rộng (có lẽ khoảng 30.000 năm trước) và loại bỏ P. vivax khỏi con người ở đó. Theo kịch bản này, P. vivax lây nhiễm cho người hiện nay đại diện cho một dòng dõi bị thắt cổ chai đã sống sót sau khi lan rộng ra khỏi Châu Phi. Gần đây hơn nhiều, cùng với sự di cư của vật chủ, P. vivax ở người đã được tái du nhập vào Châu Phi. Gần đây, một số kịch bản thay thế về nguồn gốc P. vivax ở vượn và người đã được thảo luận, nhưng không kịch bản nào trong số này có vẻ hợp lý dựa trên dữ liệu hiện tại.
Tất cả các mô hình trước đây đều cho rằng P. vivax có nguồn gốc từ người ở châu Á, sau sự lây truyền chéo loài của một loại ký sinh trùng ở khỉ, và sau đó con người đã mang ký sinh trùng này đến các loài vượn ở Châu Phi. Giả định này dựa trên thực tế là tất cả các họ hàng gần nhất được biết đến của P. vivax dường như đều lây nhiễm cho các loài linh trưởng châu Á.
Tuy nhiên, giờ đây chúng tôi chứng minh rằng tinh tinh mang một loài Plasmodium có quan hệ gần gũi hơn với P. vivax so với bất kỳ loại ký sinh trùng nào ở các loài linh trưởng châu Á. Do đó, giả định rằng tổ tiên chung của hai loài này tồn tại ở châu Phi là hợp lý hơn. Làm thế nào dòng dõi này được đưa vào các loài vượn ở châu Phi vẫn chưa được biết; tuy nhiên, điều này dường như đã xảy ra từ rất lâu trước khi P. vivax xuất hiện .
Để giải thích mức độ đa dạng di truyền hiện tại ở các chủng P. vivax ở vượn và người, các mô hình trước đây viện dẫn nguồn gốc Châu Á hoặc yêu cầu P. vivax ở người tại Châu Á phải tuyệt chủng trước khi tái sinh từ Châu Phi, hoặc cần P. vivax Châu Á phải trải qua một giai đoạn “thắt cổ chai” (nguyên nhân chưa rõ. Ngược lại, mô hình nguồn gốc Châu Phi không yêu cầu quần thể P. vivax tổ tiên (nay đã tuyệt chủng) ở người tại Châu Á mà chúng ta cần giải thích theo hướng đa dạng giảm của KSTSR ở người là kết quả của giai đoạn “thắt cổ chai” từ Châu Phi như đã từng thấy ở loài P. falciparum và ở chính con người. Người ta cũng cho rằng P. vivax có nhiều khả năng đã lan từ Châu Á sang Châu Phi hơn vì các chủng P. vivax ở người tại Châu Á dường như đa dạng nhất và vì các phân tích phát sinh địa lý cho thấy tỷ lệ di cư cao từ Châu Á, đặc biệt là Ấn Độ - sang châu Phi.
Tuy nhiên, điều này hiện được giải thích đơn giản hơn bởi sự tuyệt chủng của P. vivax ở người tại Châu Phi, nơi có tính đa dạng cao và do có sự lan rộng của đột biến Duffy âm tính trên quần thể. Các chủng P. vivax hiện đang lây nhiễm cho người ở Châu Phi thực sự có nguồn gốc từ Châu Á, nhưng điều này phản ánh sự tái du nhập và chỉ xảy ra gần đây, có lẽ cùng với sự di cư của người Châu Á đến Madagascar trong vòng vài nghìn năm qua.
Nếu nguồn gốc của P. vivax là do lây truyền từ khỉ đuôi dài ở Đông Nam Á, điều này sẽ ngụ ý một lịch sử tiến hóa phức tạp, xét đến các mốc thời gian đã được viện dẫn. Ước tính về thời điểm tổ tiên chung cuối cùng của P. vivax ở người thường vào khoảng hàng trăm nghìn năm trước. Sử dụng trình tự mtDNA, tổ tiên này được ước tính đã tồn tại khoảng 400.000 năm trước và một so sánh gần đây hơn về trình tự bộ gen nhân cho thấy một ngày tương tự. Người hiện đại được cho là đã tiến hóa ở Châu Phi và lần đầu tiên đến châu Á không quá 60.000 năm trước.
Do đó, nếu ước tính về mốc thời gian hợp nhất các dòng P. vivax ở người là chính xác, thì vật chủ nhận sự lây truyền từ khỉ đuôi dài phải là một loài hominin nào đó trước đó, và P. vivax phải đa dạng hóa trong một thời gian dài ở vật chủ đó trước khi nhiều dòng được truyền sang người hiện đại sau khi họ xuất hiện từ Châu Phi.
Sự tồn tại của ổ chứa P. vivax trong tự nhiên có ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Thứ nhất, nó giải đáp bí ẩn về các ca nhiễm P. vivax ở những du khách trở về từ vùng mà 99% dân số có Duffy âm tính. Thứ hai, nó làm dấy lên khả năng con người sống gần tinh tinh và khỉ đột có thể bị nhiễm P. vivax từ vượn.
Hình 6. Phân tích phả hệ di truyền các chủng Plasmodium vivax từ mẫu máu của các bệnh nhân sốt rét
tại Florida, Mỹ 2023 chỉ ra có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ. A) Phân bố địa lý 53 chủng chất lượng cao toàn cầu thu thập từ >1,000 mẫu P. vivax. B) Chủng P. vivax ở Florida đang kết cụm theo cụm tại
Trung/ Nam Mỹ. Cây phả hệ di truyền được cấu trúc thông qua sử dụng phương pháp tối đa hóa và 1000 bootstrap
sao chép thẻ hiện trong nhánh. Mã hóa màu sắc theo nguồn gốc địa lý của các phân lập trong bảng A. Chùm của Mỹ và Trung/ Nam Mỹ màu xám có bóng.
Các chủng Florida P. vivax được ký hiệu 1AS1, 2AS2, SAS3, 4AS4.
Nguồn: https://www.researchgate.net/Autochthonous_Plasmodium_vivax_Infections_Florida_USA2023
Một nghiên cứu gần đây về những cá nhân đến khám tại một phòng khám sức khỏe ở Congo thấy 10% mang kháng thể đặc hiệu với giai đoạn tiền hồng cầu P. vivax cho thấy sự phơi nhiễm liên tục với P. vivax từ một nguồn không xác định. Vì P. vivax từ vượn rất phổ biến, đặc biệt là ở Tây Trung Phi, tinh tinh và khỉ đột sống hoang dã có thể đóng vai trò là ổ chứa mầm bệnh, đặc biệt là ở những vùng có sự đổ bộ của người có kết quả xét nghiệm Duffy dương tính thông qua thương mại và du lịch trùng hợp với sự gia tăng xâm lấn rừng và phá hủy môi trường sống của vượn. Mặc dù những cá nhân âm tính với thụ thể Duffy thường được bảo vệ khỏi nhiễm trùng P. vivax giai đoạn trong máu, các nghiên cứu gần đây ở Madagascar và Ethiopia đã chỉ ra P. vivax không hoàn toàn phụ thuộc vào thụ thể Duffy.
Do đó, việc đánh giá khả năng KSTSR ở vượn có được kiểu hình này là rất quan trọng, một khi các yếu tố di truyền cơ bản đã được xác định trong các chủng ở người. Khả năng P. vivax ở vượn có thể lây lan qua du lịch quốc tế đến các quốc gia nơi P. vivax ở người đang lây truyền mạnh cũng cần được xem xét. Vì P. vivax ở vượn đa dạng hơn nhiều so với P. vivax ở người, nên nó có khả năng thích nghi cao hơn để né tránh các biện pháp điều trị và phòng ngừa, đặc biệt nếu KST ở người và vượn có thể tái tổ hợp.
Với khuynh hướng chuyển đổi vật chủ đã được ghi nhận của P. vivax, việc sàng lọc những người dương tính và âm tính với thụ thể Duffy ở Tây Trung Phi, cũng như các vectơ muỗi truyền bệnh, để tìm sự hiện diện của P. vivax ở vượn dường như quan trọng.
Các nghiên cứu như vậy đã trở nên khả thi nhờ sự phát triển của các công cụ phân tử giúp phân biệt P. vivax ở vượn với ở người, đồng thời cho phép sàng lọc mẫu phân để tìm DNA của KST có nguồn gốc từ gan ngay cả khi không có dấu hiệu nhiễm trùng máu rõ ràng. Những kết quả này cần thiết để hỗ trợ các nỗ lực kiểm soát và xóa bỏ sốt rét, cũng như để đánh giá nguy cơ lây truyền từ động vật sang người.
Tổng cộng 5.469 mẫu phân mới hoặc đã được thu thập trước đó từ tinh tinh sống hoang dã P. troglodytes, khỉ đột phương Tây G. gorilla, khỉ đột phương Đông G. beringei và tinh tinh lùn P. paniscus để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về retrovirus ở khỉ và KST Laverania đã được chọn để sàng lọc P. vivax .
Tất cả mẫu vật đều có nguồn gốc từ các loài vượn chưa quen với con người, ngoại trừ 170 mẫu từ tinh tinh ở Vườn Quốc gia Gombe, Tanzania và 26 mẫu từ khỉ đột ở Khu bảo tồn Dzanga-Sangha, Trung Phi, những con vật này đã quen với sự hiện diện của người quan sát. Các mẫu được thu thập (tỷ lệ 1:1) trong dung dịch RNA later, vận chuyển ở nhiệt độ môi trường và bảo quản ở -80°C. DNA phân được chiết xuất bằng bộ QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) và được sử dụng để khuếch đại các phần của bộ gen ty thể vật chủ nhằm xác nhận nguồn gốc loài và phân loài.
Một tập hợp con cũng được phân tích vi vệ tinh tại 4-8 vị trí đa hình để ước tính số lượng cá thể được lấy mẫu. Ngoài các mẫu phân từ quần thể hoang dã, họ cũng thu thập mẫu phân và máu từ tinh tinh và khỉ đột được nuôi nhốt trong các chuồng ngoài trời ngay sát môi trường sống của các loài linh trưởng hoang dã, các mẫu này gồm 113 mẫu phân và 66 mẫu máu từ tinh tinh được nuôi tại Trung tâm Cứu hộ Sanaga Yong, 2 mẫu phân từ khỉ đột và 14 mẫu máu từ tinh tinh được nuôi tại Trung tâm Động vật hoang dã Limbe và 8 mẫu máu từ 6 con tinh tinh và 2 con khỉ đột được nuôi tại Trung tâm Cứu hộ Động vật hoang dã Vườn quốc gia Mfou. Tất cả đều nằm ở Cameroon.
Các mẫu phân được thu thập từ những cá thể đã biết dưới sự quan sát trực tiếp. Các mẫu máu được lấy bằng phương pháp chọc tĩnh mạch (mẫu máu khô, máu toàn phần, lớp tế bào bạch cầu, hồng cầu) và là vật liệu còn lại từ các cuộc kiểm tra sức khỏe định kỳ hoặc được thu thập cho các mục đích thú y (chẩn đoán) cụ thể. Việc thu thập máu và phân đã được Bộ Lâm nghiệp và Động vật hoang dã Cameroon phê duyệt. Hai con tinh tinh tại khu bảo tồn SY bị nghi ngờ mắc bệnh sốt rét và được lấy mẫu trong thời gian bị sốt cao. Một con có kết quả xét nghiệm máu dương tính tại chỗ và sau đó được xác định là dương tính với P. reichenowi bằng phương pháp PCR , trong khi con kia dương tính P. vivax ở vượn bằng phương pháp PCR, cả hai đều đáp ứng tốt với điều trị thuốc sốt rét. Một vài con tinh tinh khác dương tính với Laverania hoặc P. vivax ở vượn bằng PCR đều có các triệu chứng nhẹ hơn tại hoặc gần thời điểm lấy mẫu, nhưng phần lớn các con vượn nuôi nhốt, bao gồm cả một số con dương tính với Laverania và/hoặc trình tự không phải Laverania qua phân tích máu, đều không có triệu chứng tại thời điểm lấy máu.
Hình 7. Các mốc lịch sử nghiên cứu về KSTSR Plasmodium vivax trên thế giới
https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2023.1144453/full
Những cá thể này cũng có kết quả xét nghiệm máu âm tính. Các mẫu được vận chuyển tuân thủ các quy định của Công ước về Thương mại Quốc tế các Loài Động thực vật hoang dã nguy cấp và giấy phép nhập khẩu và xuất khẩu cụ thể của từng Quốc gia. DNA được chiết xuất từ máu toàn phần và các vết máu khô bằng bộ QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Mẫu bệnh phẩm khỉ
Để điều tra phạm vi vật chủ đầy đủ của P. vivax, họ đã sàng lọc mẫu máu từ 998 loài linh trưởng không phải người ở Cameroon và Congo. Việc thu thập và đặc điểm phân tử các mẫu đã được mô tả, ngoại trừ mẫu từ các địa điểm thực địa. Các mẫu được thu thập từ thịt thú rừng linh trưởng dưới dạng các đốm máu khô hoặc máu toàn phần bằng các chiến lược được thiết kế đặc biệt để không làm tăng nhu cầu. DNA được chiết xuất bằng kit máu QIAamp (Qiagen, Courtaboeuf, Pháp) và nguồn gốc loài được xác định bằng cách khuếch đại một đoạn mtDNA 386 bp gồm gen 12S rRNA bằng PCR một vòng. Các mẫu linh trưởng không phải người được thu thập với sự chấp thuận của Bộ Y tế và Môi trường và Ủy ban Đạo đức Quốc gia của Cameroon và Congo.
Mẫu bệnh phẩm người
Để tăng số lượng trình tự tham chiếu P. vivax ở người và tạo ra các trình tự không có lỗi PCR, đã thu thập mẫu toàn cầu về các ca nhiễm P. vivax ở người. Các mẫu này gồm mẫu máu khô hoặc mẫu DNA từ (i) 61 du khách Quốc tế được chẩn đoán tại Phòng thí nghiệm tham chiếu sốt rét của Trường Y học Nhiệt đới và Vệ sinh London, Anh (được ký hiệu là MRL), (ii) 35 du khách Quốc tế được chẩn đoán tại Khoa Bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Đại học Karolinska, Stockholm, Thụy Điển (được ký hiệu là SW) và (iii) 32 cư dân của các khu vực lưu hành sốt rét ở Trung Quốc (được ký hiệu là GX; n=10), Myanmar (V0; n=10), Thái Lan (PVAR; n=2) và Ấn Độ (IN; n=10), những người đã tìm kiếm điều trị tại các phòng khám địa phương. Trong tất cả trường hợp, nhiễm P. vivax ban đầu được xác định bằng kính hiển vi và được xác nhận bằng PCR chẩn đoán tiếp theo là giải trình tự khuếch đại trực tiếp.
DNA được chiết xuất từ máu toàn phần hoặc mẫu máu khô bằng Bộ dụng cụ QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Các mẫu ADN ẩn danh được MRL thu thập trước đây được cung cấp theo nhiệm vụ của trung tâm để thực hiện giám sát dịch tễ học liên quan đến bệnh sốt rét nhập khẩu vào Vương quốc Anh. Tất cả các đối tượng khác đã cung cấp sự đồng ý bằng văn bản cho việc thu thập và phân tích mẫu, các mẫu được gửi đi mà không có thông tin nhận dạng bệnh nhân và các thông tin khác của bệnh nhân, ngoại trừ quốc gia (đã biết hoặc được cho là) nơi nhiễm P. vivax . Nghiên cứu đã được Hội đồng Đánh giá Đạo đức của Đại học Pennsylvania, Viện Karolinska và Đại học Tiểu bang Pennsylvania phê duyệt.
Loài Plasmodium khác
DNA bộ gen từ mẫu máu khô chứa P. inui (mã số MRA-486F), P. simiovale (MRA-488F), P. cynomolgi (MRA-350G) và P. fragile (MRA-352G) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Thuốc thử Tham chiếu và Nghiên cứu Sốt rét (MR4) để tạo ra các trình tự tham chiếu có nguồn gốc từ bộ gen đơn lẻ phục vụ cho các phân tích phát sinh chủng loài. Các mẫu phân của vượn được phân tích bằng phương pháp microsatellite đã được báo cáo, ngoại trừ các mẫu tinh tinh lùn thu được tại điểm thực địa TL. DNA trong phân được chiết xuất và sử dụng để khuếch đại 08 vị trí microsatellite đa hình. Các sản phẩm khuếch đại được phân tích trên máy giải trình tự tự động và được xác định kích thước bằng GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems).
Để nhận dạng cá thể, các mẫu phải được nhóm theo kiểu gen mtDNA. Trong mỗi kiểu gen, các mẫu sau đó được nhóm theo kiểu gen microsatellite. Vì các mẫu bị phân hủy một phần do bảo quản lâu ở nhiệt độ môi trường, cho phép sai lệch alen ở tối đa 6 vị trí để phòng ngừa mất alen, nhưng chỉ khi chúng đại diện cho một alen bị thiếu. Phương pháp xác định kiểu gen thận trọng này có thể đánh giá thấp số lượng cá thể được sàng lọc, nên phản ánh ước tính tối thiểu. Mẫu có bằng chứng về sự pha trộn DNA (nhiều đỉnh cho cùng một vị trí) đã bị loại bỏ.
PCR chẩn đoán P. vivax & SGA của trình tự gen P. vivax
Các mẫu phân và máu được sàng lọc bằng PCR để tìm trình tự ty thể (cox1 ) của P. vivax, dù ban đầu được thiết kế để khuếch đại trình tự P. vivax từ các mẫu đồng nhiễm với Laverania, song các mồi cũng được tìm thấy có khả năng khuếch đại mtDNA của Hepatocystis spp. Mồi Pv2768p (5′-GTATGGATCGAATCTTACTTATTC-3′) và Pv3287n (5′-AATACCAGATACTAAAAGACCAACAATGATA-3′) được dùng trong vòng PCR đầu tiên, trong khi Pv2870p (5′-TTGCAATCATAAAACTTTAGGTC-3′) và Pv3185n (5′-TCCTCCAAATTCTGCTGCTGTAGATAAAATG-3′) được dùng trong vòng thứ hai, tạo ra sản phẩm khuếch đại 297 bp. Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng điện di và giải trình tự trực tiếp để xác nhận nhiễm Plasmodium spp.
Để thu được các trình tự P. vivax không có lỗi PCR gồm cả sự kết hợp sai do trùng hợp Taq gây ra và sự chuyển đổi khuôn mẫu, mẫu máu và phân từ vượn và người bị nhiễm P. vivax đã được xử lý bằng phương pháp SGA, về cơ bản như đã mô tả trong tài liệu tham khảo. DNA được chiết xuất và pha loãng điểm cuối sao cho ít hơn 30% phản ứng PCR tạo ra sản phẩm khuếch đại. Theo phân bố Poisson, một giếng tạo ra sản phẩm PCR ở độ pha loãng này sẽ chỉ chứa một khuôn mẫu có thể khuếch đại duy nhất trong hơn 83% thời gian. Nhiều vùng gen khác nhau đã được khuếch đại, gồm các đoạn ty thể S, A, B, C và D; gen clpC của apicoplast (574 bp) và các gen nhân ldh (713-724 bp), asl (838 bp), crk 2 (666 bp) và β-tub (684 bp).
Mồi được thiết kế trong các vùng bảo tồn của bộ gen P. vivax, ngoại trừ một bộ mồi ldh nhằm khuếch đại các KST khỉ đa dạng hơn, được thiết kế bằng cách sử dụng cả trình tự đồng thuận của P. vivax và P. knowlesi. Điều kiện chu kỳ PCR được mô tả như trong tài liệu tham khảo, ngoại trừ thời gian kéo dài khác nhau tùy thuộc vào chiều dài của đoạn khuếch đại (1 phút cho mỗi 1 kb chiều dài đoạn khuếch đại).
Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự trực tiếp và phân tích bằng phần mềm Sequencher (Gene Ann Arbor). Tất cả trình tự có đỉnh kép trong sắc ký đồ đều bị loại bỏ, ngoại trừ trình tự có nguồn gốc từ mẫu phân khỉ chứa một đỉnh kép duy nhất. Đỉnh kép đơn trong trình tự SGA cho thấy sự hiện diện của hai biến thể P. vivax khác nhau bởi một nucleotide duy nhất hoặc sự kết hợp sai PCR trong vòng PCR đầu tiên hoặc thứ hai, đã giải quyết các vị trí không rõ ràng này bằng cách chọn nucleotide giống hệt với trình tự đồng thuận P. vivax của khỉ. Cách tiếp cận thận trọng này đã tránh được việc mất đi thông tin trình tự có giá trị.
Định kiểu gen DARC
Để kiểm tra xem vượn bị nhiễm và không bị nhiễm P. vivax có biểu hiện đa hình trình tự trong vùng promoter DARC và/hoặc các trình tự mã hóa liền kề hay không, chúng tôi đã khuếch đại một vùng 1.286 bp của gen DARC trong hai đoạn PCR chồng chéo một phần từ 134 mẫu vượn (phân và máu). Đoạn A được khuếch đại bằng cách dùng DARCpF1 (5′-GCTGTCCCATTGTCCCCTAG-3′) và DARCpR8 (5′-GGCCCCATACTCACCCTGTGC-3′) trong vòng PCR đầu tiên và DARCpF3 (5′-GCACAATGATACACAGCAAAC-3′) và FYPdn (5′-CCATGGCACCGTTTGGTTCAGG-3′) trong vòng thứ hai. Đoạn B được khuếch đại bằng cách sử dụng DARC_F5 (5′-AGGCAGTGGGCGTGGGGTAAG-3′) và DARC_R5 (5′-AGCCATACCAGACACAGTAGCC-3′) trong vòng 1 và DARC_NTF1 (5′-TTGGCTCTTATCTTGGAAGCAC-3′) và DARC_NTR1 (5′-TGGTGAGGATGAAGAAGGGCAGT-3′) trong vòng thứ 2. Điều kiện PCR giống như điều kiện được sử dụng để khuếch đại mtDNA của P. vivax . Các sản phẩm khuếch đại được giải trình tự trực tiếp và phân tích bằng phần mềm Sequencher.
Đối với các địa điểm mà số lượng tinh tinh được lấy mẫu, tỷ lệ nhiễm P. vivax được ước tính dựa trên tỷ lệ cá thể dương tính (nhưng đã hiệu chỉnh theo độ nhạy của xét nghiệm; xem bên dưới), với giới hạn tin cậy 95% được xác định dựa trên giả định lấy mẫu nhị thức. Đối với các địa điểm thực địa mà số lượng cá thể được lấy mẫu chưa được biết, tỷ lệ nhiễm bệnh được ước tính dựa trên số lượng mẫu phân, nhưng đã hiệu chỉnh theo sự suy thoái mẫu vật, lấy mẫu quá mức và độ nhạy của xét nghiệm PCR chẩn đoán.
Độ nhạy của PCR chẩn đoán được ước tính bằng cách xác định tỷ lệ mẫu dương tính với PCR từ những con vượn bị nhiễm P. vivax được lấy mẫu nhiều hơn một lần trong cùng một ngày, như đã mô tả trước đây, gồm dữ liệu từ 14 con vượn (6 con tinh tinh trung tâm, 5 con tinh tinh phía đông và 3 con khỉ đột phía Tây), ước tính độ nhạy 32% (17/53 mẫu dương tính; giới hạn tin cậy được xác định dựa trên giả định lấy mẫu nhị thức). Sử dụng giá trị đã được báo cáo trước đó cho việc lấy mẫu quá mức và 1,84 lần lượt cho tinh tinh trung, khỉ đột phía tây, tinh tinh phía đông, khỉ đột phía đông và tinh tinh lùn) và sự suy giảm mẫu 10 (0,13), tỷ lệ vượn dương tính với trình tự P. vivax được ước tính cho mỗi điểm thực địa. Tuy nhiên, vì việc phát hiện P. vivax trong mẫu phân kém nhạy hơn đáng kể so với trong máu, nên tỷ lệ hiện mắc thu được nên được hiểu là ước tính tối thiểu.
Tính toán sự đa dạng nucleotide
Các trình tự P. vivax mới được tạo ra từ vượn và người đã được hiệu chỉnh với các trình tự từ bộ gen hoàn chỉnh của 5 chủng tham chiếu P. vivax (Salvador I, Ấn Độ VII, Mauritania I, Triều Tiên và Brazil I). Ngoài 5 chủng tham chiếu này, chỉ có các trình tự có nguồn gốc từ SGA mới được đưa vào phân tích, để tránh làm tăng giá trị đa dạng bằng cách bao gồm các lỗi do trùng hợp Taq gây ra. Các trình tự giống hệt nhau từ cùng một mẫu hoặc cá thể đã bị loại trừ. Các trình tự giống hệt nhau từ các mẫu hoặc cá thể khác nhau được giữ lại.
Đối với mỗi gen, các trình tự được căn chỉnh bằng ClustalW và cả hiệu chỉnh P. vivax của vượn và người đều được cắt gọn đến cùng độ dài. Sự đa dạng nucleotide ( π ) của các trình tự KST ở người và vượn được tính toán cho 6 đoạn gen P. vivax (đoạn mtDNA D, apicoplast clpC, nhân ldh, asl, crk2 và β-tub) bằng cách dùng DnaSP phiên bản 5.10.
Tính toán khoảng cách từ P. cynomolgi & Phân tích phát sinh loài
Đối với mỗi gen P. vivax, cùng một tập hợp các trình tự được dùng để tính toán sự đa dạng đã được căn chỉnh với một trình tự tham chiếu P. cynomolgi. Khoảng cách từ mỗi trình tự P. vivax đến trình tự tham chiếu P. cynomolgi được tính toán bằng cách dùng gói R phiên bản 3.0-8 với hiệu chỉnh Tamura–Nei và khoảng cách trung bình được tính toán cho mỗi gen. Trình tự sắp xếp được xây dựng bằng ClustalW phiên bản 2.1 và được điều chỉnh thủ công bằng MacClade. Các vùng không thể sắp xếp rõ ràng đã bị loại bỏ khỏi các phân tích phát sinh học tiếp theo. Trình tự gen nhân được phân tích tái tổ hợp bằng GARD. Các mô hình tiến hóa cho phân tích phát sinh học được xác định bằng tiêu chí thông tin Akaike với Modeltest và PAUP. Cây phát sinh học khả năng tối đa với hỗ trợ bootstrap (100 lần lặp lại) được ước tính cùng với các giá trị tham số mô hình bằng PhyML sử dụng cả trao đổi lân cận gần nhất và hiệu chỉnh nhánh con và ghép lại với Neighbor Joining và 10 cây khởi đầu bổ sung ngẫu nhiên. Xác suất hậu nghiệm cho các nút trong cây phát sinh học được tính toán bằng MrBayes, sử dụng độ lệch chuẩn trung bình của tần số phân vùng <0,01 làm chẩn đoán hội tụ.
(Hết)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gething, P. W. et al. A long neglected world malaria map: Plasmodium vivax endemicity in 2010. PLoS Negl. Trop. Dis. 6, e1814 (2012).
2. Mendis, K., Sina, B. J., Marchesini, P. & Carter, R. The neglected burden of Plasmodium vivax malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 97-106 (2001).
3. Miller, L. H., Mason, S. J., Clyde, D. F. & McGinniss, M. H. The resistance factor to Plasmodium vivax in blacks. The Duffy-blood-group genotype, FyFy. New Engl. J. Med. 295, 302–304 (1976).
4. Livingstone, F. B. The Duffy blood groups, vivax malaria, and malaria selection in human populations: a review. Hum. Biol. 56, 413–425 (1984).
5. Carter, R. & Mendis, K. N. Evolutionary and historical aspects of the burden of malaria. Clin. Microbiol. Rev. 15, 564–594 (2002).
6. Mu, J. et al. Host switch leads to emergence of Plasmodium vivax malaria in humans. Mol. Biol. Evol. 22, 1686–1693 (2005).
7. Escalante, A. A. et al. A monkey’s tale: the origin of Plasmodium vivax as a human malaria parasite. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 1980–1985 (2005).
8. Carlton, J. M., Das, A. & Escalante, A. A. Genomics, population genetics and evolutionary history of Plasmodium vivax. Adv. Parasitol. 81, 203–222 (2013).
9. Tachibana, S. et al. Plasmodium cynomolgi genome sequences provide insight into Plasmodium vivax and the monkey malaria clade. Nat. Genet. 44, 1051–1055 (2012).
10. Liu, W. et al. Origin of the human malaria parasite Plasmodium falciparum in gorillas. Nature 467, 420–425 (2010).
11. Krief, S. et al. On the diversity of malaria parasites in African apes and the origin of Plasmodium falciparum from bonobos. PLoS Pathog. 6, e1000765 (2010).
12. Kaiser, M. et al. Wild chimpanzees infected with five Plasmodium species. Emerg. Infect. Dis. 16, 1956–1959 (2010).
13. Prugnolle, F. et al. Diversity, host switching and evolution of Plasmodium vivax infecting African great apes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 8123–8128 (2013).
14. Paupy, C. et al. Anopheles moucheti and Anopheles vinckei are candidate vectors of ape Plasmodium parasites, including Plasmodium praefalciparum in Gabon. PLoS One 8, e57294 (2013).
15. Duval, L. et al. African apes as reservoirs of Plasmodium falciparum and the origin and diversification of the Laverania subgenus. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 10561–10566 (2010).
16. Santiago, M. L. et al. SIVcpz in wild chimpanzees. Science 295, 465 (2002).
17. Santiago, M. L. et al. Foci of endemic simian immunodeficiency virus infection in wild-living eastern chimpanzees (Pan troglodytes schweinfurthii). J. Virol. 77, 7545–7562 (2003).
18. Keele, B. F. et al. Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV-1. Science 313, 523–526 (2006).
19. Li, Y. et al. Eastern chimpanzees, but not bonobos, represent a simian immunodeficiency virus reservoir. J. Virol. 86, 10776–10791 (2012).
20. Liu, W. et al. Single genome amplification and direct amplicon sequencing of Plasmodium spp. DNA from ape fecal samples. Protoc. Exch. doi:10.1038/nprot.2010.156 (2010) ).
21. Rayner, J. C., Liu, W., Peeters, M., Sharp, P. M. & Hahn, B. H. A plethora of Plasmodium species in wild apes: a source of human infection? Trends Parasitol. 27, 222–229 (2011).
22. Tournamille, C., Colin, Y., Cartron, J. P. & Le Van Kim, C. Disruption of a GATA motif in the Duffy gene promoter abolishes erythroid gene expression in Duffy negative individuals. Nat. Genet. 10, 224–228 (1995).
23. King, C. L. et al. Fya/Fyb antigen polymorphism in human erythrocyte Duffy antigen affects susceptibility to Plasmodium vivax malaria. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 20113–20118 (2011).
24. Aghokeng, A. F. et al. Extensive survey on the prevalence and genetic diversity of SIVs in primate bushmeat provides insights into risks for potential new cross-species transmissions. Infect. Genet. Evol. 10, 386–396 (2010).
25. Ahuka-Mundeke, S. et al. Novel multiplexed HIV/simian immunodeficiency virus antibody detection assay. Emerg. Infect. Dis. 17, 2277–2286 (2011).
26. Kedzierski, L. et al. Phylogenetic analysis of the genus Plasmodium based on the gene encoding adenylosuccinate lyase. Infect. Genet. Evol. 1, 297–301 (2002).
27. Contacos, P. G. et al. Transmission of Plasmodium schwetzi from the chimpanzee to man by mosquito bite. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 190–195 (1970).
28. Hamblin, M. T. & Di-Rienzo, A. Detection of the signature of natural selection in humans: evidence from the Duffy blood group locus. Am. J. Hum. Genet. 66, 1669–1679 (2000).
29. Culleton, R. & Carter, R. African Plasmodium vivax: distribution and origins. Int. J. Parasitol. 42, 1091–1097 (2012).
30. Tanabe, K. et al. Plasmodium falciparum accompanied the human expansion out of Africa. Curr. Biol. 20, 1283–1289 (2010).
31. Ramachandran, S. et al. Support from the relationship of genetic and geographic distance in human populations for a serial founder effect originating in Africa. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 15942–15947 (2005).
32. Cornejo, O. E. & Escalante, A. A. The origin and age of Plasmodium vivax. Trends Parasitol. 22, 558–563 (2006).
33. Tofanelli, S. et al. On the origins and admixture of Malagasy: new evidence from high-resolution analyses of paternal and maternal lineages. Mol. Biol. Evol. 26, 2109–2124 (2009).
34. Neafsey, D. E. et al. The malaria parasite Plasmodium vivax exhibits greater genetic diversity than Plasmodium falciparum. Nat. Genet. 44, 1046–1050 (2012).
35. Mellars, P. Going east: new genetic and archaeological perspectives on the modern human colonization of Eurasia. Science 313, 796–800 (2006).
36. Carter, R. Speculations on the origins of Plasmodium vivax malaria. Trends Parasitol. 13, 214–219 (2003).
37. Guerra, C. A. et al. The international limits and population at risk of Plasmodium vivax transmission in 2009. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e774 (2010).
38. Culleton, R. et al. Evidence for the transmission of Plasmodium vivax in the Republic of the Congo, West Central Africa. J. Infect. Dis. 200, 1465––1469 (2009).
39. Ménard, D. et al. Plasmodium vivax clinical malaria is commonly observed in Duffy-negative Malagasy people. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 5967––5971 (2010).
40. Woldearegai, T. G. et al. Plasmodium vivax malaria in Duffy-negative individuals from Ethiopia. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 107, 328–331 (2013).
41. Keele, B. F. et al. Increased mortality and AIDS-like immunopathology in wild chimpanzees infected with SIVcpz. Nature 460, 515–519 (2009).
42. Rudicell, R. S. et al. High prevalence of simian immunodeficiency virus infection in a community of savanna chimpanzees. J. Virol. 85, 9918–9928 (2010).
43. Neel, C. et al. Molecular epidemiology of simian immunodefiociency virus infection in wild-living gorillas. J. Virol. 84, 1464–1476 (2009).
44. Etienne, L. et al. Non-invasive follow-up of simian immunodeficiency virus infection in wild-living nonhabituated western lowland gorillas in Cameroon. J. Virol. 86, 9760–9772 (2012).
45. Aghokeng, A. F. et al. Widely varying SIV prevalence rates in naturally infected primate species from Cameroon. Virology 345, 174–189 (2006).
46. Sundararaman, S. A. et al. Plasmodium falciparum-like parasites infecting wild apes in southern Cameroon do not represent a recurrent source of human malaria. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 7020–7025 (2013).
47. Zimmerman, P. A. et al. Emergence of FY*Anull in a Plasmodium vivax-endemic region of Papua New Guinea. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 13973–13977 (1999).
48. Larkin, M. A. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947–2948 (2007).
49. Librado, P. & Rozas, J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25, 1451–1452 (2009).
50. Paradis, E., Claude, J. & Strimmer, K. APE: Analyses of Phylogenetics and Evolution in R language. Bioinformatics 20, 289–290 (2004).
51. Tamura, K. & Nei, M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10, 512–526 (1993).
52. Maddison, W. P. & Maddison, D. R. MacClade—Analysis of Phylogeny and Character Evolution—Version 4 Sinauer Associates, Inc. (2001).
53. Kosakovsky Pond, S. L., Posada, D., Gravenor, M. B., Woelk, C. H. & Frost, S. D. Automated phylogenetic detection of recombination using a genetic algorithm. Mol. Biol. Evol. 23, 1891–1901 (2006).
54. Posada, D. & Buckley, T. Model selection and model averaging in phylogenetics: advantages of akaike information criterion and bayesian approaches over likelihood ratio tests. Syst. Biol. 53, 793–808 (2004).
55. PAUP* 4.0: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods) v. 4.0b2a Sinauer Associates, Inc.: Sunderland, MA, (1999).
56. Guindon, S., Delsuc, F., Dufayard, J. F. & Gascuel, O. Estimating maximum likelihood phylogenies with PhyML. Methods Mol. Biol. 537, 113–137 (2009).
57. Guindon, S. et al. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Syst. Biol. 59, 307–321 (2010).
58. Ronquist, F. & Huelsenbeck, J. P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19, 1572–1574 (2003).
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn