9. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm:
Dễ thực hiện, có thể phát hiện virus hiện diện với số lượng ít trong mẫu, phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thời gian ngắn hơn so với các phương pháp truyền thống; Thu được số lượng lớn gen mục tiêu với nguyên liệu đầu vào ít, phù hợp trong sản xuất công nghiệp.
Nhược điểm
Có thể xảy ra hiện tượng “dương tính giả” khi bộ mồi bắt vào một trình tự khác không phải trình tự mục tiêu; Cần biết chính xác trình tự hai đầu gen mục tiêu để tạo đoạn mồi; PCR rất nhạy cảm với ô nhiễm, do đó một lượng nhỏ DNA không sạch (nhiễm protein, ARN) có thể dẫn đến kết quả sai lệch hoặc không rõ ràng; DNA polymerase dễ lỗi và có khả năng gây đột biến trên sản phẩm PCR.
Giải pháp để tối ưu và tăng tốc phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR được tiến hành trong các phòng thí nghiệm hiện là phương pháp nhanh nhất và an toàn nhất để khuếch đại ADN, tuy nhiên phương pháp này chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như ADN mẫu làm khuôn, chất lượng của enzyme ADN polymerase, chất lượng mồi và thiết bị, dụng cụ. Do đó, nhu cầu tăng tốc và tối ưu hóa phản ứng PCR là rất lớn và nó có thể được tiếp cận theo nhiều cách khác nhau. Bài viết này giới thiệu một số giải pháp giúp tối ưu và tăng tốc phản ứng PCR.
Giải pháp nâng cao chất lượng của PCR
Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme Taq polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Yếu tố cơ bản để thực hiện PCR gồm: (i) Sợi khuôn DNA (chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế 2 mồi oligonucleotide); (ii) Hai đoạn mồi ngắn để xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA (mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung); (iii) Có đầy đủ nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP; (iv) Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và ADNse; (v) Enzyme chịu nhiệt Taq. Trong PCR, thường dựa vào bộ hoá chất có khả năng mang lại năng suất tối ưu cùng với quy trình nhanh hơn. Song, việc chuẩn bị mẫu, cũng như thiết bị, vật tư tiêu hao trong quy trình làm PCR sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng theo những cách không được đánh giá thường xuyên. Vì vậy, một số giải pháp đã được đưa ra nhằm cải thiện và tăng tốc độ của phản ứng PCR.
Thứ nhất, cải thiện vật liệu block nhiệt phù hợp làm tăng tốc độ gia nhiệt và hạ nhiệt. Vật liệu dẫn nhiệt được dùng làm hợp kim cho block nhiệt bên trong thiết bị PCR có tác dụng tăng và hạ nhiệt. Nhôm là vật liệu tiêu chuẩn thường được dùng, tuy nhiên block nhiệt cấu tạo từ hợp kim bạc sẽ đạt được tốc độ gia nhiệt nhanh gấp đôi. Tốc độ gia nhiệt và hạ nhiệt nhanh giúp phản ứng PCR diễn ra nhanh hơn. Điều quan trọng là nhiệt độ phải đạt được một cách đáng tin cậy, với độ lệch tối thiểu, độ vượt giá trị được kiểm soát và để đảm bảo điều này, cần kiểm tra định kỳ, lý tưởng là sử dụng bộ thiết bị về kiểm tra nhiệt độ Temperature Verification System (TVS);
Thứ hai, công nghệ gradient nhiệt 2 chiều mới giúp tối ưu hoá phản ứng PCR. Công nghệ gradient nhiệt giúp tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhanh chóng. Tính năng này là một cuộc cách mạng trong quá trình tối ưu hoá phản ứng PCR. Tuy nhiên để xác định nhiệt độ biến tính tối ưu, cần phải chạy thêm một hoặc nhiều phản ứng PCR nữa.
Một lần nữa, công nghệ 2D-gradient được phát triển, khi đó nhiệt độ biến tính khác nhau có thể được chọn trong mỗi hàng, trong khi đồng thời nhiệt độ gắn mồi khác nhau được chọn trong mỗi cột. Nhiệt độ tối ưu sẽ ngăn chặn sự biến tính và gắn mồi không hoàn chỉnh. Tính năng này cho phép xác định nhiệt độ tối ưu và dẫn đến năng suất tối đa cũng như kết quả PCR lặp lại tối ưu;
Thứ ba, tối ưu hóa vật tư tiêu hao để tăng tốc phản ứng PCR. Một cách khác để tăng tốc phản ứng PCR là việc sử dụng bộ hoá chất PCR được phát triển đặc biệt kết hợp với ống PCR nhanh. Ống PCR nhanh có thành ống mỏng, đồng thời duy trì sự ổn định của chúng - một tính năng cho phép gia nhiệt và hạ nhiệt mẫu nhanh hơn. Nhiệt độ bên trong mẫu đạt đồng đều hơn và với sự trợ giúp của bộ PCR nhanh, một lần chạy PCR được hoàn thành trong vòng 16 phút.
Thêm vào đó, việc sử dụng ống PCR nhanh mang lại năng suất ADN tăng hơn nhiều lần.
Thứ tư, số lượng mẫu nhiều, kiểm soát tập trung sẽ làm giảm thời gian cho các quy trình chạy phản ứng PCR. Nếu có nhiều hơn một máy PCR để chạy chương trình trong phòng thí nghiệm, và được kiểm soát tập trung sẽ làm giảm thời gian thao tác với máy. Với máy PCR của hãng Eppendorf, 50 máy PCR khác nhau sẽ được kết nối vào trong một mạng và được điều khiển bằng phần mềm trung tâm, theo cách này có thể dùng 30 máy chạy chương trình thứ nhất và 20 máy chạy chương trình thứ hai. Đối với các phòng thí nghiệm số lượng mẫu thấp hơn, 9 máy PCR có thể kết nối mạng lan với nhau và được điều khiển trên một bảng điều khiển của một máy chính. Điều này giúp tiết kiệm thời gian trong quá trình cài đặt chương trình.
Ngoài ra, có thể tối ưu hóa các kết quả PCR thông qua các điều chỉnh thiết kế mồi, thành phần của hỗn hợp PCR master mix hoặc quy trình chuẩn bị mẫu. Thêm vào đó, sự kết nối của nhiệt độ biến tính và nhiệt độ gắn mồi cũng như thời gian kéo dài chuỗi có thể rất quan trọng đối với lượng ADN cụ thể, độ tinh khiết và chất lượng của nó. Rất đáng để thử nghiệm tất cả các tùy chọn trước khi mua một bộ mới hoặc đặt hàng mồi mới.
10. Một số ưu điểm đặc biệt của realtime-PCR trong nghiên cứu Y sinh học
Tương tự như PCR, thì realtime PCR cũng là một kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào chu kỳ nhiệt. Tuy nhiên, trong kỹ thuật PCR cần phải đợi PCR hoàn tất thì mới tiếp tục dùng một số kỹ thuật khác, chẳng hạn như điện di sản phẩm PCR trên gel agarose mới có thể xác định sự hiện diện của trình tự khuếch đại.
Còn trong kỹ thuật realtime PCR thì tín hiệu khuếch đại sẽ được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó mà người thực hiện có thể theo dõi được kết quả PCR mà không cần đợi đến khi hoàn tất, cũng như không cần phải thực hiện thêm một số kỹ thuật khác.Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR có trục tung (Y) là cường độ tín hiệu huỳnh quang đo được từ phản ứng PCR, còn trục hoành (X) là số chu kỳ nhiệt. Trong các chu kỳ đầu, tín hiệu huỳnh quang phát ra chưa đủ mạnh để máy có thể đo được, đường tín hiệu sẽ nằm ngang (gọi là tín hiệu nền). Khi số bản sao DNA đủ lớn, máy sẽ bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra, và tín hiệu lúc này sẽ tăng lên sau mỗi chu kỳ nhiệt, giai đoạn này gọi là giai đoạn lũy thừa (log phase).
Hình 11. Điểm khác biệt giữa PCR và realtime PCR trong chẩn đoán bệnh
Đến một chu kỳ nào đó, phản ứng cạn kiệt nguyên liệu và enzyme Taq polymerase cũng không hoạt động hiệu quả nữa dẫn đến tín hiệu sẽ không tiếp tục gia tăng, giai đoạn này gọi là giai đoạn bình nguyên.
Hình 12. Biểu đồ khuếch đại của một quy trình realtime PCR
Trên biểu đồ khuếch đại (Hình 1) có một thông số rất quan trọng đó là chu kỳ ngưỡng (Ct), đây là chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR bắt đầu vượt qua đường tín hiệu nền. Trong phản ứng realtime PCR, tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu mà Ct sẽ xuất hiện sớm hay muộn. Mẫu ban đầu nhiều thì Ct sẽ xuất hiện sớm và ngược lại, mẫu ban đầu ít thì Ct sẽ xuất hiện muộn.
Về đường chuẩn của realtime PCR,khi đem một mẫu chuẩn có hàm lượng DNA đã xác định đi pha loãng bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tất cả các nồng độ pha loãng đi chạy realtime PCR ta sẽ được các giá trị chu kỳ ngưỡng Ct khác nhau. Đường biểu diễn mối liên hệ giữa Ct và hàm lượng DNA được gọi là đường chuẩn realtime PCR (Hình 2), trên đường chuẩn sẽ có 2 thông số quan trọng cần quan tâm:
- Hệ số tương quan (R2):Đánh giá độ chính xác của thao tác pipette, hệ số R2 càng gần giá trị 1 thì thao tác càng chính xác. Thông thường giá trị R2 ≥ 0,99.
- Hiệu quả khuếch đại (E):Trong điều kiện lý tưởng giá trị E = 100%, tuy nhiên trong thực tế thì giá trị E chấp nhận được ở mức 90 - 105%.
Dựa vào đường chuẩn và giá trị Ct của mẫu đầu vào, ta có thể định lượng chính xác hàm lượng DNA bên trong mẫu. Đây là ưu điểm vượt trội của realtime PCR khi so sánh với PCR, do trong kỹ thuật PCR thì tín hiệu được quan sát lúc phản ứng đã kết thúc nên cường độ tín hiệu không còn tương quan chính xác với lượng DNA đầu vào nên không thể sử dụng cho định lượng.
Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan
Trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Bài viết lần này sẽ giới thiệu về cách dựa trên mẫu dò TaqMan, đây là một loại mẫu dò (probe) được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật realtime PCR. Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan gần như tương đồng với một phản ứng PCR thông thường, ngoại trừ việc trong thành phần có chứa thêm mẫu dò TaqMan.
Hình 13. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan
Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có 2 giai đoạn:Biến tính ở 94-95oC trong 15-30 giây và giai đoạn bắt cặp và kéo dài ở 60oC trong 30-60 giây.
Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR
Thay lời kết
Xét nghiệm sinh học phân tử là một trong những phương pháp xét nghiệm hiện đại đang được dùng phổ biến trong ngành y sinh học. Kỹ thuật này ra đời vào cuối thế kỷ XX dựa trên phương pháp khuếch đại chuỗi tạo ra các phản ứng PCR để từ đó giúp nhận diện và định lượng các yếu tố nguyên nhân gây nên bệnh. Hiện PCR được ứng dụng phổ biến trong chẩn đoán các bệnh lý do virus HIV, HBV, HCV như đo tải lượng HBV-DNA trên hệ thống tự động, HBV đo tải lượng Real-time PCR.
Phản ứng PCR là một công cụ mang tính “cách mạng” trong lĩnh vực sinh học phân tử. Kỹ thuật này mở ra những ứng dụng quan trọng trong y sinh học, pháp y, nghiên cứu gen và nhiều lĩnh vực khác. Các kỹ thuật mới dựa trên nền PCR càng khai phá thêm tiềm năng ứng dụng như real-time PCR hay dd PCR. Hiện nay, PCR đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện đại.
(Hết)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- PCR test in medical diagnosis. https://pctu.edu.vn/en/pcr-test-in-medical-diagnosis.html
- https://pacificlab.vn/vi/news/blog-kien-thuc/ PCR là gì, ứng dụng của PCR trong lĩnh vực y học hiện đại
- https://abtvn.com/ Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong chẩn đoán sinh học phân tử
- https://th-science.com.vn/vn/Ứng dụng của phương pháp PCR và real-time PCR trong Công nghệ sinh học
- Mingke Wang, Jin Cai, Jinhong Chen, Jingwen Liu, Xiaoyu Geng, Xuelu Yu, Jishun Yang (2022). pCR Techniques and Their Clinical Applications. https://www.intechopen.com/chapters/86086
- Hình anh truy cập từ các trang website tại Việt Nam và trên thế giới
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang & TS. Nguyễn Thị Liên Hạnh
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn