3. Một số kỹ thuật PCR thường dùng trong y học
Kỹ thuật PCR do nhà sinh học người Mỹ là Kary Mullis phát triển vào năm 1980, đóng góp quan trọng trong lĩnh vực gen học, y học, Kể từ đó PCR có nhiều cải tiến với các phiên bản hiện đại hơn PCR truyền thống về mặt công nghệ để cải thiện độ chính xác, độ nhạy và tốc độ thực hiện (RT-PCR, qPCR, và nested PCR).Hiện nay người ta thường dùng một số kỹ thuật sau:
- PCR đơn mồi (Simplex PCR):
Kiểu PCR này tương đối cổ điển, nó chỉ dùng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại cho 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất mà thôi;
- PCR đa mồi (Multiplex PCR):
Kỹ thuật PCR dùng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại cho các trình tự mục tiêu khác nhau có trong cùng 1 mix phản ứng. Muốn tạo được phản ứng đa mồi thì các cặp mồi dùng cần phải có cùng nhiệt độ bắt cặp, chúng không được bắt cặp cùng hoặc bắt cặp chéo nhau. Ngoài ra, độ nhạy PCR đa mồi cần tương đương đơn mồi. Tuy nhiên, PCR đa mồi thường được dùng ở các tế bào nuôi cấy vì trình tự đích sẽ có số lượng đủ lớn để không đòi hỏi quá “khắt khe” về độ nhạy. Đây là phương pháp phát hiện đồng thời nhiều trình tự ADN mục tiêu chỉ trong một giếng phản ứng bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau. Kỹ thuật giúp tối ưu hóa chi phí và thời gian thực hiện phản ứng. Hiện nay, người ta sử dụng phổ biến multiplex PCR trong nghiên cứu khoa học, chẩn đoán lâm sàng và khoa học pháp y.
- PCR lồng hay PCR tổ (Nested PCR):
Kỹ thuật PCR tổ cần có 2 cặp mồi: 1 cặp bên ngoài và 1 cặp bên trong. Trong đó, cặp mồi bên ngoài tham gia PCR lần 1 trước nhằm làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích; còn cặp mồi bên trong tham gia PCR lần 2 giúp phát hiện trình tự đích. Thường thì khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích cho độ nhạy kém người ta sẽ sử dụng kỹ thuật PCR lồng;
- RT-PCR:
Khi trình tự đích là RNA thì sẽ sử dụng quy trình kỹ thuật RT-PCR. Muốn vậy, trước khi PCR, cần thực hiện thêm bước dùng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA. Đây chính là giai đoạn RT. Trong đó, RT-PCR 1 bước chỉ thực hiện RT và PCR trong 1 ống nghiệm duy nhất, các thành phần cho RT lẫn cho PCR đều chứa cả trong mix ban đầu; RT-PCR 2 bước ủ RT ở 1 ống nghiệm riêng. Để thực hiện PCR, người ta sẽ cho DNA tạo thành vào ống nghiệm chứa PCR mix.
RT-PCR là phương pháp khuếch đại ARN thay vì ADN nên chúng thường ứng dụng nhằm phát hiện các chủng virus có vật liệu di truyền ARN như SARS-CoV. RT-PCR sử dụng một enzyme chuyển phân tử ARN thành phân tử ADN. Các cặp mồi sau đó được gắn vào phân tử ADN này; các bước trong quy trình tương tự với PCR truyền thống.
- Realtime PCR:
Bản chất realtime PCR cũng là quá trình nhân bản DNA trong ống nghiệm, tuy nhiên ưu điểm là có khả năng hiển thị kết quả ngay tại từng thời điểm (realtime) và được ứng dụng trong các xét nghiệm định lượng như định lượng virus viêm gan B, viêm gan C. Để có được ưu điểm trên, ngoài thành phần tương tự như một phản ứng PCR truyền thống, trong phản ứng realtime PCR còn được bổ sung các đoạn đầu dò gắn huỳnh quang, các huỳnh quang này sẽ được máy đọc thu nhận lại và báo cáo trên màn hình hiển thị.Đối với phương pháp PCR truyền thống, số lượng bản sao DNA chỉ được xác định tương đối tại thời điểm kết thúc phản ứng.
Trong khi đó, realtime PCR cho phép định lượng chính xác số lượng bản sao ADN sau mỗi chu kì.Trong phương pháp realtime PCR, người ta đưa vào phản ứng một phân tử có khả năng phát huỳnh quang. Khi số lượng bản sao ADN tạo ra càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang càng cao. Người ta gắn một bộ phận theo dõi tính hiệu huỳnh quang vào máy luân nhiệt nhằm xác định số lượng trình tự ADN theo thời gian thực. Do đó, phương pháp này còn được gọi là PCR định lượng (quantitative PCR).
Droplet digital PCR (ddPCR):
Phương pháp ddPCR là kỹ thuật PCR sử dụng hệ thống giọt nhũ tương nước-dầu. Hệ thống này tạo ra hàng nghìn giọt nhũ tương nước-dầu có chứa DNA bên trong. Các giọt nhũ tương có chức năng tương tự như ống nghiệm, cung cấp môi trường cho DNA nhân đôi. Phương pháp này giúp định lượng chính xác và dễ dàng DNA mục tiêu, đồng thời giảm lượng hóa chất và mẫu cần sử dụng cho phản ứng.
4. Quy trình thực hiện và lưu ý về bệnh phẩm của xét nghiệm PCR
4.1. Quy trình thực hiện
Để thực hiện xét nghiệm PCR thì tất cả thành phần PCR cần được trộn lẫn nhau, sau đó thông qua chuỗi 3 phản ứng chính ở một máy điều nhiệt tự động với quy trình gồm 3 bước:
+ Biến tính (Denaturation 950C): Tách DNA mạch đôi thành DNA mạch đơn bằng nhiệt;
+ Bắt cặp (Annealing 40-700C): cho phép sự bắt cặp giữa mồi với khuôn mẫu DNA;
+ Kéo dài (Elongation 720C): Mạch mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung nhờ DNA polymerase
- Bước 1: Biến tính hay làm nóng hỗn hợp PCR phản ứng đến 940C trong thời gian 15-30 giây, giúp cho DNA sợi kép bị phá vỡ trong liên kết hydro yếu, nên biến tính thành những chuỗi đơn.
- Bước 2: Ủ hay giai đoạn hạ nhiệt độ xuống 54-600C, duy trì khoảng 20-40 giây để giúp các mồi được ủ với trình tự bổ sung của chúng có trong DNA mẫu.
- Bước 3: Kéo dài với nhiệt độ cần đạt là 72-800C. Đây là giai đoạn enzyme polymerase tuần tự bổ sung các bazơ, mở rộng trình tự DNA, khi đạt điều kiện tối ưu, sẽ có thêm DNA polymerase trong 1.000 bp/phút.
Hình 7. Quy trình thực hiện PCR thường quy chung
4.2. Lưu ý bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm phải được lấy đúng chỗ, đúng vùng cần xác định sự hiện diện của DNA đang muốn tìm; Đảm bảo tinh sạch về mặt sinh học đối với dụng cụ và dụng cụ lấy và chứa bệnh phẩm. Nếu không sạch thì nó sẽ làm phân hủy các acid nucleic tác nhân đích có trong mẫu hoặc khiến cho mẫu thử chứa các chất ức chế phản ứng khuyếch đại về sau. Ngoài ra, đồ dùng này chỉ được phép dùng duy nhất 1 lần.
Mặc dù xét nghiệm PCR có độ chính xác cao đối với chẩn đoán nhiều bệnh lý nhưng muốn đạt được điều đó, cần tiến hành trong môi trường xét nghiệm, trang thiết bị y tế hiện đại và đội ngũ nhân sự giàu kinh nghiệm. Tất cả yếu tố này chỉ có được ở một CSYT được đầu tư bài bản về cơ sở vật chất lẫn đội ngũ nhân lực. Không dùng được cho những bệnh nhân đang điều trị kháng sinh tại vị trí lấy bệnh phẩm hoặc đang trong chu kỳ kinh nguyệt với các bệnh phẩm đường sinh dục, mẫu bệnh phẩm lẫn máu, bệnh phẩm lấy vào ống chống đông heparin, bệnh phẩm bảo quản trong formol, bệnh phẩm có lẫn sợi bông. Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (PCR mix). Trong PCR mix sẽ chứa các thành phần:
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55-65oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu như chất ethidium bromide có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV.
5. Tạp nhiễm từ ngoài lên sản phẩm PCR
Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, nên các phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục không sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được “thảm họa” này khi toàn bộ các lần chạy PCR đều ra “dương tính”, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ toàn bộ hóa chất, khử nhiễm toàn bộ phòng thí nghiệm. Dù vậy điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.
Hình 8. Một số ví dụ về tạp nhiễm trong quá trình thực hiện PCR
|Nguồn: PureBiotech LLC, 2024
Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu, đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật (khuôn) sẽ không chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm mà không ảnh hưởng đến khuôn.
6. Ứng dụng PCR trong lĩnh vực Y sinh học
- Phương pháp PCR giúp chẩn đoán một số bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng, vi nấm gây bệnh khác. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy hoặc khi đã sử dụng kháng sinh/kháng ký sinh trùng;
- Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc là một ứng dụng quan trọng của PCR, giúp xác định sự kháng thuốc và hướng dẫn quyết định điều trị;
- Phương pháp PCR được dùng để phát hiện các biểu hiện gen liên quan đến ung thư, giúp xác định “nguyên nhân phần nào có thể”, đặc điểm di truyền và hướng dẫn quyết định điều trị;
- PCR là công cụ quan trọng trong nghiên cứu gen học, giúp phân tích cấu trúc gen, tìm hiểu về các biểu hiện gen và nghiên cứu về di truyền học;
- PCR có vai trò quan trọng trong việc xác định các loại gen HLA, có tác dụng quan trọng trong tìm kiếm người hiến tặng tạng và tủy xương;
- Phương pháp PCR có thể được sử dụng để xác định có mặt hay không các độc tố của vi sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh;
- Realtime PCR EV, EV71, CMV, EBV, Adeno virus, sởi, ho gà, lao, HSV, RSV, tải lượng virus HBV … realtime PCR đa mồi trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh hô hấp, tiêu hóa, viêm não-màng não.
Hình 9. Một số ứng dụng PCR trong lĩnh vực Y sinh học
|Nguồn: esearchgate.net/publication/373834786_Micro-PCR forpointof care detection&beyond a review microfluidics &nanofluidics
7. An toàn sinh học phòng thí nghiệm
Nhân viên y tế được trang bị đầy đủ và đúng cách với bảo hộ cá nhân, gồm quần áo, giày bảo hộ để che phủ toàn bộ cơ thể, đeo khẩu trang, mũ bảo hộ, kính chống giọt bắn. Nhân viên y tế cũng cần sử dụng găng tay y tế khi tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân hoặc các chất dịch cơ thể. Găng tay giúp ngăn chặn vi khuẩn và virus từ bệnh nhân không lẫn vào tay của nhân viên y tế;
Trang phục bảo hộ chỉ được dùng trong khu vực làm việc và không được mang ra ngoài để tránh lây nhiễm chéo. Sau mỗi lần sử dụng, trang phục bảo hộ cần được loại bỏ và xử lý theo quy định về quản lý chất thải y tế.Các biện pháp này cần được thực hiện một cách nghiêm túc để đảm bảo an toàn tối đa cho cả bệnh nhân và nhân viên y tế.
8. Bảo quản, vận chuyển mẫu xét nghiệm PCR và hiệu chuẩn
Quy trình bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm là yếu tố quan trọng đối với chất lượng kết quả xét nghiệm PCR. Bệnh phẩm càng được chuyển đến phòng thí nghiệm sớm, càng giúp đảm bảo tính chính xác của kết quả.Thời gian bảo quản cũng phụ thuộc vào loại mẫu. Nếu không thể vận chuyển ngay, mẫu cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-80C) để giảm quá trình phân hủy.
Trước khi tiến hành hiệu chuẩn phải thực hiện các bước: (i) Vệ sinh máy và kiểm tra hoạt động của máy theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất;(ii) Chuẩn bị các cặp nhiệt điện rồi đặt đầu của cặp nhiệt điện vào máy PCR, sau đó dùng vật liệu cách nhiệt lắp kín ngõ vào, các đầu của cặp nhiệt điện được đặt cố định phân bổ đều trong máy, lắp các cặp nhiệt điện vào máy đo theo đúng vị trí các kênh ghi nhiệt độ theo các kênh tương ứng.
Kiểm tra bên ngoài theo các yêu cầu: Xem xét và ghi thông tin về tên, nhãn hiệu, kiểu/loại, số hiệu, chỉ thị nhiệt độ của phương tiện đo, phạm vi hoạt động, độ phân giải của nhà sản xuất.
Hình 10. Các bước kiểm tra để đảm bảo chất lượng của xét nghiệm PCR
Nguồn: https://www.gene-quantification.de/strategy.html
Kiểm tra kỹ thuật theo các yêu cầu: Bộ chỉ thị nhiệt độ hoạt động ổn định, không có hiện tượng thay đổi đột ngột, biến động, các số hiển thị phải rõ nét, không bị mờ hoặc mất nét.Máy PCR được kiểm tra đo lường theo trình tự các nội dung, phương pháp và các yêu cầu sau đây:Số điểm nhiệt độ được chia đều trong dải nhiệt độ cần hiệu chuẩn và không ít hơn 2 điểm; hiệu chuẩn từ điểm thấp đến điểm cao nhất; Đặt nhiệt độ bể nhiệt của máy PCR ở nhiệt độ cần hiệu chuẩn và cho máy hoạt động; Sau khi nhiệt độ đạt trạng thái ổn định (quan sát bộ chỉ thị nhiệt của máy thấy giá trị nhiệt độ không thay đổi hoặc nhiệt độ dao động xung quanh một giá trị tương ứng hoặc lân cận với giá trị nhiệt độ được cài đặt); Tiến hành ghi giá trị nhiệt độ Tj của bộ chỉ thị và các giá trị tij của từng vị trí của nhiệt kế chuẩn.
Ghi nhận kết quả hiệu chuẩn này làm nhiều lần trong khoảng thời gian cỡ 30 phút, số lần ghi nhiệt độ sao cho đủ để xác định được nhiệt độ cực đại, cực tiểu và trung bình của chuẩn; Quá trình đọc số chỉ từ bộ hiển thị của UUT đến nhiệt kế chuẩn thứ 1, lần lượt đến nhiệt kế chuẩn thứ n về lại bộ chỉ thị của UUT là một lượt đọc. Số lượt đọc tại mổi điểm kiểm tra không ít hơn 3 lần; Lần lượt kiểm tra ở các điểm tiếp theo.
Độ hồi trễ của UUT (Amax) sẽ được tính tại điểm hiệu chuẩn nào có giá trị trung bình sai lệch lớn nhất theo chiều hiệu chuẩn tăng và giảm nhiệt độ.Quá trình kiểm tra đo lường đánh giá các chỉ tiêu: Xác định sai số của chỉ thị, kiểm tra độ ổn định, kiểm tra độ đồng đều, độ chênh lệch, độ hồi trễ tại mỗi điểm hiệu chuẩn và tính toán độ không đảm bảo đo. Máy PCR đạt tất cả yêu cầu kiểm tra được dán tem hiệu chuẩn và cấp giấy chứng nhận hiệu chuẩn.Chu kỳ hiệu chuẩn được khuyến nghị là 1 năm.
(còn nữa)
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang & TS. Nguyễn Thị Liên Hạnh
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn