(Tiếp theo Phần I): I. Đánh giá hiệu lực thuốc qua thử nghiệm In vivo
II. Đánh giá nhạy kháng thuốc qua kỹ thuật In vitro
Khu vực Đông Nam châu Á đóng vai trò quan trọng như là một tiêu điểm xuất hiện những chủng P.falciparum kháng thuốc đầu tiên trên thế giới, trong đó đáng chú ý là vùng biên giới Thái Lan-Myanmar, Thái Lan-Cambodia. Ca sốt rét P.falciparum kháng chloroquin đầu tiên được phát hiện trên thế giới là dọc theo biên giới Thái Lan-Cambodia năm 1959. Sự giảm nhạy của P.falciparum với dẫn suất của artemisinine cũng bắt đầu có xu hướng giảm dần theo thời gian sử dụng, cụ thể tại Trung Quốc, việc dùng artemisinine đơn trị liệu hơn một thập niên với quy mô lớn, tính nhạy của P.falciparum trên in vitro với artesunate giảm đáng kể từ 1988-1999, nồng độ ức chế (IC50) tăng lên gấp đôi, nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) tăng gấp 3 lần; ở Việt Nam, nơi mà artemisinine dùng đơn trị liệu phạm vi lớn cho thấy IC50 vẫn ổn định từ 1998-2001, trong khi IC90 và IC99 phải tăng đến 2-4 lần. Ngoài ra, một số quốc gia khác như Cambodia, Cameroon, Thái Lan cũng cho kết quả như thế;
Trước những thông báo về kháng thuốc ngày càng tăng về phạm vi và mức độ. WHO đã thành lập một nhóm gồm các nhà khoa học nghiên cứu về ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc. Từ đó, các kỹ thuật in vivo và in vitro được thiết kế từ những năm 1980s, với mục đích phát hiện kháng thuốc sớm, cũng như đánh giá lại hiệu lực thuốc sốt rét đang dùng và đã ngừng dùng sau một thời gian (chẳng hạn chloroquine). Qua thời gian, các quy trình này được điều chỉnh và cải tiến thường xuyên để phù hợp với điều kiện thực tế tại thực địa và la bô theo thời gian 1997, 1999, 2001, 2005, 2007.
Tại việt Nam, hiện các kỹ thuật này đã và đang thực hiện thường quy trong các chương trình và đề tài cũng như nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc sốt rét tại Viện Sốt rét KST-CT TƯ, Viện Sốt rét KST-CT Quy Nhơn, Viện Sốt rét KST-CT Thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Phòng dịch quân đội và một số nơi khác như Trung tâm phòng chống Sốt rét KST-CT tại Việt Nam.
A. Quy trình thử thuốc in vitro tại thực địa
Kỹ thuật invitro micro- test được giáo sư Rieckmann giới thiệu năm 1978 và trở thành phương pháp chuẩn của WHO từ năm 1980 đến nay. Quy trình này mô tả phương pháp để xác định sự nhạy cảm in vi tro của Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét tại thực địa. Phương pháp có ưu điểm áp dụng cùng một thời điểm trên nhiều bệnh nhân (trong cùng 1 plate), ký sinh trùng nuôi cấy trong labô rất điển hình, in vitro cho biết kết quả nhanh hơn theo dõi in vivo, song lại có nhược điểm là chúng không thể thay thế được hoàn toàn in vivo và trang thiết bị đắt tiền.
Hiện nay chưa có kít để thử thuốc cho ký sinh trùng sốt rét P.vivax
1. Nguyên lý và cách tiến hành các bước của kỹ thuật:
-Giai đoạn hồng cầu của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) sẽ phát triển trong ống nghiệm nếu được ủ ấm ở nhiệt độ 37.50C trong môi trường nuôi cấy và môi trường khí giàu CO2.
-Thuốc có tác dụng ức chế sự tạo thành schizont của KSTSR nhạy ở giai đoạn hồng cầu;
-Nên tạo môi trường đầy đủ khí CO2 và O2 như trong máu tính mạch để nuôi cấy thành công tôi đa, nếu chúng ta gặp chủng nhạy càng nhiều thì càng khó nuôi cấy đạt mục đích;
-Thông thường chu kỳ phát triển 48 giờ với nhiệt độ 37.5 ± 0.50C
a. Yêu cầu của kỹ thuật:
-Đảm bảo vô trùng (vì đây là môi trường giàu chất dinh dưỡng rất hấp dẫn với vi khuẩn);
-Môi trường và phiến nhựa thuốc phải được bảo quản ở 40C;
-Đảm bảo tính đồng nhất về nguồn cung cấp thuốc thử, dung môi, quy trìnhkỹ thuật.
b. Chọn thuốc thử
Thuốc đang được chương trình quốc gia phòng chống sốt rét dùng để điều trị bệnh nhân sốt rét ở các tuyến y tế.
c. Nguyên liệu và dụng cụ
-Chọn bàn làm việc nơi không có gió lùa để tránh đưa bụi vào,…trước khi tiến hành nên đưa các plate từ nơi cất giữ ra ngoài môi trường để ở nhiệt độ phòng cho ấm, rồi mới đưa mẫu máu có ký sinh trùng vào nếu không ký sinh trùng dễ chết (do nhiệt độ môi trường không phù hợp)
-Phiến nhựa 96 giếng đáy phẳng đã được cài đặt thuốc cần thử theo các nồng độ khác nhau (phiến nhựa và thuốc vô trùng). Những phiến nhựa này có thể nhận từ:
§Đặt mua của Tổ chức y tế thế giới (WHO),
§Hoặc tự pha (do Viện Sốt rét KST-CT TƯ pha sẵn theo các nồng độ quy định). Cần lưu ý là thuốc artemisinine và một số dẫn chất khi pha xong để được trong thời gian rất ngắn.
-Ống mao dẫn (capillary) tráng chất chống đông (chuyên dụng cho nuôi cấy KSTSR).
-Miếng nhựa plastic dính dùng để dán lên mặt trên phiến nhựa.
-Dao nhỏ cắt giấy nhựa,
-Dung dịch môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (vô trùng),
-Dung dịch NaHCO3 5% (vô trùng),
-Pipet eppendorff cps thể hút các thể tích khác nhau 1ml; 0.2ml; 50µl;
-Các đầu col vô trùng chuyên dụng cho những pipet này,
-Tube để đựng môi trường có dung tích 5ml (vô trùng).
-Bình nuôi cấy và nến đốt không tạo khói,
-Tủ ấm, bình ắc quy và dụng cụ sạc ắc quy, tủ lạnh
-Lam kính thường và lam kính chuyên dụng cho in vitro, dung dịch giêmsa, kính hiển vi.
-Bông, cồn nồng độ 700
d. Quy trình tiến hành.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:
-Bệnh nhân nhiễm loại KSTSR P.falciparum đơn thuần;
-Mật độ KSTSR thể vô tính từ 1000 – 80.000 KST/µl máu (nếu lớn hơn sẽ không đủ lượng dinh dưỡng để nuôi);
-Phát hiện việc dùng thuốc (không được uống thuốc sốt rét trước đó):
§Phát hiện thuốc thuộc nhóm 4-aminoquinolein trong nước tiểu bằng test Dill-Glazko phải (-);
§Hỏi tiền sử dùng thuốc: bệnh nhân không dùng thuốc Artemisinine và dẫn suất trước đó 7 ngày;
§Trong trường hợp nghi ngờ, thử nghiệm có thể được tiến hành, nhưng phải lấy máu để phân tích về sự tồn lưu của thuốc.
-Khi bệnh nhân đủ tiêu chuẩn, tiến hành các bước tiếp theo.
2.1.2. Kiểm tra nhiệt độ tủ ấm có ổn định không và làm ấm bình nến.
2.1.3.Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và làm ấm môi trường.
-Công thức pha môi trường RP:
§10 ml môi trường;
§0.4ml NaHCO3 5%
-Công thức tạo hỗn dịch máu- môi trường cho 1 thuốc thử:
§0.9 ml môi trường RPMI
§0.1 ml máu toàn phần từ bệnh nhân.
2.1.4. Lấy máu nuôi cấy
-Sát trùng đầu ngón tay bằng bông cồn 700 (thường là ở ngón nhẫn, bàn tay trái), để khô tự nhiên; dùng kim chích đầu ngón tay, nặn máu, dùng bông khô (vô trùng) lau giọt máu đầu;
-Vuốt nhẹ đầu ngón tay từ dưới lên, để máu ra từng giọt, dùng ống mao dẫn lấy 0.1ml máu, đẩy máu từ ống mao dẫn vào tube chứa sẵn 0.9 ml môi trường 9nên lấy máu liên tục, không để ngắt quãng, oxy dễ vào);
-Làm 2 lam máu: một lam giọt dày, một lam giọt mỏng.
-Có thể lấy máu tĩnh mạch để nuôi cấy (nếu mật độ ³ 3.000 KST/µl máu), cần quyết định giờ nuôi khi nào cho thích hợp từng loại ký sinh trùng;
-Chú ý tủ ấm phải điều chỉnh nhiệt độ phù hợp trước khi nuôi cấy!
2.1.5. Chuyển máu vào phiến nhựa (plate)
-Dùng dao cắt hoặc dùng cái cư răng mịn cắt phiến nhựa dính trên các giếng, mỗi thuốc cắt một cột, có thể thử 2 cột với lượng máu kể trên.
* Lưu ý: Nên nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô trùng, không có thuốc để thăm dò sự phát triển của KSTSR trước giờ thu hoạch tốt nhất.
-Dùng pipet eppendorff, nhỏ 50µl hỗn dịch máu + môi trường vào mỗi giếng thử, bắt đầu từ giếng A và đi theo trình tự, cuối cùng là giếng H nghĩa là nồng độ cao dần (có thể dùng một đầu tip). Luôn luôn vừa làm vừa lắc tube để đảm bảo dịch treo như nhau;
-Vừa hút, vừa lắc lọ dung dịch, gõ nhè nhẹ plate cho hòa thuốc với dung dịch;
-Đậy nắp phiến nhựa, ghi số hiệu bệnh nhân, thời gian bắt đầu nuôi trên nắp theo đúng cột tương ứng;
-Vì lượng hỗn dịch nhỏ vào giếng rất ít nên có khả năng dính trên thành giếng, do vậy sau khi đậy nắp phiến nên gõ ngón tay và lắc nhẹ nhàng phiến nhựa;
-Lấy bình nến ra ngoài tủ ấm, đặt phiến nhựa vào bình nến, đặt một đĩa nhựa có miếng bông thấm nước cất vào bình (làm giảm sự bay hơi của môi trường), đốt nến, đậy nắp bình nến, khi nến gần tắt, khoá van của bình nến;
-Đặt bình nến vào tủ ấm, cài đặt nhiệt độ tủ ấm ở 37.50C;
-Thời gian thu hoạch: dựa vào hình thể KSTSR lúc đưa vào nuôi cấy. Nếu các KSTSR trẻ thì thời gian ủ ấm từ 33–35 giờ, KSTSR giai đoạn trung bình thì thời gian ủ ấm từ 28-32 giờ, KSTSR già thì chỉ nên ủ ấm khoảng chừng 23–25 giờ;
-Nên thăm dò trước ở các giếng nuôi thêm (đề cập ở trên) trước khi thu hoạch mẫu (đó là lý do nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô trùng không có thuốc). Nếu kết quả chưa đạt, ta nên tiếp tục ủ thêm vài giờ nữa nếu cần thiết;
-Trước khi đặt plate vào môi trường nuôi cấy nên có giữ độ ẩm (lấy cục bông thấm nước bỏ vào trong).
2.1.6. Thu hoạch, nhuộm lam và xét nghiệm lam đánh giá sau nuôi cấy.
-Vì sau một thời gian dài nuôi cấy, ủ trong tủ ấm nên phần lớn hồng cầu lắng xuống phía dưới, ta dùng pipet eppendorff hút dịch nổi ở trên, hồng cầu còn lại lắng bên dưới được lấy làm thành những giọt máu dày trên lam chuyên dụng, trình tự 2 dãy theo quy định;
-Lây lam chuyên dụng cho nuôi cấy đánh code bệnh nhân và bắt đầu tiến hành.
* Chú ý: nếu thu hoạch từ giếng A- H thì đầu tip (đầu col) phải được đổi sau mỗi giếng thực hiện xong, có thể dùng 1 đầu tip để thu hoạch từ giếng H-A (nghĩa là trình tự ngược lại so với lúc đưa hỗn dịch vào trong giếng)
Well A à Well B à Well C à Well D
Well E à Well F à Well G à Well H
(nồng độ thuốc cao nhất)
-Nhuộm lam: lam máu phải được làm khô cẩn thận (để ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ hoặc trong tủ ấm 37.50C qua đêm). Thường nhuộm với dung dịch giêm sa nhuộm nồng độ 1- 2%, dung dịch đệm pH = 6,8 trong 30-45 phút.
* Chú ý: nên kiểm tra nồng độ giêm sa và thời gian thích hợp trước khi nhuộm.
2. Đếm ký sinh trùng sốt rét
-Một mẫu thử được đánh giá là thành công khi số lượng schizonte ở giếng chứng phải bằng hoặc lớn hơn 10% trong tổng số 200 KSTSR thể vô tính.
-Đếm số lượng schizonte từ 3 nhân trở lên trong tổng số 200 KSTSR thể vô tính (bao gồm cả schizonte và tư dưỡng).
3. Phân tích số liệu.
-Số liệu có ý nghĩa khi thực hiện thành công 30 mẫu thử hoặc hơn.
-Hiện nay trên thế giới có sử dụng một chương trình để đánh giá nhạy kháng thuốc sốt rét trên in vitro rất tiện lợi.
4. Xác định mức nhạy, kháng in vitro theo nồng độ tiêu chuẩn của WHO.
Xác định kháng in vitro được rút ra từ đáp ứng in vivo của những bệnh nhân không có miễn dịch. Tiêu chuẩn nhạy, kháng in vitro trong bảng dưới đây tương quan với đáp ứng in vivo ở những bệnh nhân không miễn dịch:
Loại TSR cần thử | Đáp ứng nhạy (không phát triển schizont ở): | Đáp ứng kháng (Phát triển schizont ở): |
Chloroquine | 4 pmol hoặc thấp hơn | 8 pmol hoặc cao hơn (1) |
Mefloquine | 16 pmol hoặc thấp hơn | 32 pmol hoặc cao hơn |
Quinine | 128 pmol hoặc thấp hơn | 256 pmol hoặc cao hơn |
Amodiaquine | 2 pmol hoặc thấp hơn | 4 pmol hoặc thấp hơn |
Halofantrine | 1,5 pmol hoặc thấp hơn* | 5 pmol hoặc cao hơn* |
Artemisinine | ** | ** |
Pyronaridine | ** | ** |
Piperaquine | ** | ** |
(1) nếu ở nồng độ 8 mà vẫn còn schizonte thì cần xem là kháng thuốc
* và ** là những nồng độ đánh giá ngưỡng nhạy-kháng chưa có thống nhất giữa các quốc gia trên thế giới cũng như chưa có tiêu chuẩn cụ thể từ Tổ chức y tế thế giới, đang chờ kết quả và đề nghị từ Tổ chức y tế thế giới, đặc biệt là chương trình phòng chống sốt rét toàn cầu (Global Malaria Programme)..
Xác định các chỉ số đánh giá trong nghiên cứu in vitro:
-Tỷ lệ phần trăm schizont bị ức chế ở mỗi nồng độ thuốc so với chứng;
-Nồng độ ức chế 50% (IC50); 90% (IC90) hoặc 99% (IC99) sự phát triển của KSTSR và độ tin cậy (CI) là 95%;
-Các chỉ số trên được xác định dựa trên phần mềm của WERNSDORFER, (1995), hiện đã cập nhật theo một phần mềm mới để đánh giá nhanh và tiện lợi hơn.
B. Quy trình kỹ thuật thử thuốc sốt rét tại La bô
WHO không quy định phương pháp chuẩn chung cho labô, mỗi labô tự chọn phương pháp phù hợp với điều kiện trang thiết bị và kỹ thuật viên. Một số phương pháp thử thuốc sốt rét được áp dụng tại labô cổ điển như phương pháp nuôi ủ với thuốc trong thời gian 72 giờ của Beal và Thai Thong (1983), phương pháp đồng vị phóng xạ của Desjar (1979), phương pháp ủ thuốc trong 48 giờ của Nguyễn Đình Phúc (1980).
Hiện nay, Viện Sốt rét-KST- CT TƯ đang áp dụng phương pháp thử thuốc 48 giờ của Nguyễn Đình Phúc (1980).
1. Mục đích:
Quy trình này mô tả phương pháp để xác định sự nhạy cảm in vi tro của plasmodium falciparum với thuốc sốt rét tại labô. Ngoài ra, phương pháp này còn được dùng để đánh giá hiệu lực in vi tro của thuốc SR cũng như sàng lọc các chất có hoạt tính chống SR.
2. Nguyên lý:
-Giai đoạn hồng cầu của ký sinh trùng (KST) sẽ phát triển trong ống nghiệm nếu được ủ ấm 37,00C-37,50Ctrong môi trường nuôi cấy và môi trường khí giàu CO2;
-Thuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của KST ở giai đoạn hồng cầu.
3. Yêu cầu của kỹ thuật:
-Biết nuôi cấy KST P.falciparum dài ngày
-Đảm bảo vô trùng
-Thao tác chuẩn xác
4. Nguyên tắc:
Đối với thử nghiệm đánh giá sự nhạy cảm thuốc in vitro của các phân lập thu thập từ thực địa:
Thử nghiệm được tiến hành khi các phân lập đã thích nghi với điều kiện nuôi cấy tại la bô, có khả năng nhân lên tương tự như chủng chuẩn T996 và K1. Chủng T996 và K1 được thử đồng thời với các phân lập mới. Thuốc được lựa chọn đưa vào thử là các thuốc đang được chương trình quốc gia phòng chống sốt rét chỉ định dùng để điều trị bệnh nhân sốt rét. Thuốc được dùng làm chứng là chloroquin.
Đối với đánh giá hiệu lực in vitro của thuốc, hoặc sàng lọc các chất có hoạt tính với KST sốt rét:
Tiến hành thử trên chủng chuẩn nhạy chloroquin (T996) và chủng chuẩn kháng chloroquin (K1) và thuốc được dùng làm chứng là chloroquin.
5. Xác định nồng độ an toàn của dung môi
Nguyên liệu và dụng cụ thao tác tương tự như trong kỹ thuật nuôi cấy dài ngày P.falciparum.
Nguyên liệu và dụng cụ cho thử thuốc
-Chủng chuẩn nhạy chloroquin (T996)
-Chủng chuẩn kháng chloroquin (K1)
-Thuốc làm chứng là chloroquin
-Thuốc thử khác
-Dung môi
-Phiến nhựa 96 giếng
-Pipet eppendorff
-Tube đựng dung dịch thuốc
-Môi trường đầy đủ, huyết thanh, hồng cầu
6. Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị KST cho thử thuốc:
KST cần được cấy thêm cho thử thuốc trước khi thử 2 ngày để đạt đến mật độ 3 – 5% hồng cầu nhiễm. Tiến hành làm giảm mật độ KST xuống còn 0,25 – 0,3%, và hematocrit 40% .Thể tích mẫu nuôi cần được tính trước, dựa trên số lượng thuốc thử, dãy nồng độ thuốc và số giếng thử.
Chuẩn bị thuốc thử:
-Xác định dung môi của thuốc,
-Xác định dãy nồng độ thuốc,
-Cân thuốc,
-Pha thuốc
Tiến hành thử thuốc
-Thử nghiệm được tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng ;
-Mỗi nồng độ được thử trong 2 giếng
-Mỗi giếng của thử được nhỏ 100ml môi trường không thuốc cho giếng chứng và 100ml môi trường có thuốc cho các giếng thử.
-Mỗi giếng thử được nhỏ 10ml dịch treo hồng cầu nhiễm 0,25 – 0,3% và hematocrit 40%.
-Phiến nhựa được đặt vào bình nến, đưa bình nến vào tủ ấm 370C, ủ ấm 48 giờ. Sau 24 giờ thay khí và sau 48 thu hoạch. Lấy mẫu nuôi ra , làm lam giọt mỏng. Nhuộm Giêm sa, soi trên kính hiển vi và đếm số lượng hồng cầu nhiễm KST/10.000 hồng cầu để xác định IC50 và MIC (Minimum inhibitor concentration).
-Thực nghiệm được tiến hành 2 lần, mỗi nồng độ của mẫu thử được thử với 2 giếng.
7. Phân tích số liệu.
-Xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) sự phát triển của KST: dựa trên phần mềm Probit.
-Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó mật độ KST sau khi thử bằng mật độ KST đưa vào thử, dựa theo tiêu chuẩn của Beal-Thai Thong,1983.
III. Kỹ thuật sinh học phân tử khuếch đại chuỗi DNA
Ý nghĩa của phương pháp này là phân tích về mặt gen học của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc, đánh giá và nhận định xem đây là một trường hợp tái phát (recrudescence/ relapse) hay tái nhiễm (reinfection) của một ca sốt rét do P.falciparum hoặc P.vivax.
Kỹ thuật này có thể thực hiện hoặc không khi đánh giá P.falciparum ở vùng sốt rét lan truyền từ thấp đến trung bình nhưng bắt buộc phải thực hiện PCR ở vùng lan truyền cao để phân biệt giữa tái phát (cùng dòng KSTSR) và tái nhiễm (khác dòng KSTSR), phân tích kiểu gen dựa trên đa dạng di truyền của những kiểu gen ký sinh trùng sốt rét như SMP1, SMP2 và GLURP (msp1, msp2 và glurp). Dữ liệu kiểu gen các dòng KSTSR trước và sau đựơc so sánh với nhau theo từng cặp.
Về cách lấy mẫu: hoặc lấy 2-3 giọt máu lên trên giấy thấm Whatmann 3mm từ các bệnh nhân ở mẫu thứ nhất bất kỳ nếu bệnh nhân nào đủ tiêu chuẩn nghiên cứu. Mẫu thứ 2 được lấy ở thời điểm thất bại điều trị (hoặc sau ngày thứ D7); hoặc để hạn chế phiền hà đến bệnh nhân lấy máu lại, chúng ta nên lấy 2-3 giọt máu vào giấy thấm Whatmann 3mm đối với mỗi bệnh nhân theo quy trình sàng lọc và tại mỗi thời điểm thất bại điều trị lấy lam máu theo protocol và sau D7.
Các mẫu giấy thấm sẽ được đánh code (số nghiên cứu, ngày theo dõi,…), bảo quản trong hộp nhựa cá nhân hoặc túi bóng với chất chống ẩm, tránh ánh sáng, độ ẩm và nhiệt độ quá cao, giữ nhiệt độ thường ở thực địa và 40C trong phòng thí nghiệm cho đến khi tách chiết DNA. Kỹ thuật PCR được làm để so sánh các cặp mẫu giấy thấm để tách chiết DNA của KSTSR và phân tích kiểu gen trên những ca thất bại điều trị. Những mẫu được mã hóa trước khi giải trình tự để nhân viên la bô không cần quan tâm đến hiệu quả lâm sàng là gì.
IV. Đánh giá và đo nồng độ thuốc sốt rét trong huyết tương của bệnh nhân
Trước khi đi vào phần này, điểm qua một số đặc điểm của dược học, trong đó bao gồm:
•Dược lý học (Pharmacology): là khoa học nghiên cứu sự tương tác giữa THUỐC và CƠ THỂ SỐNG, trong đó 2 lĩnh vực quan trọng:
•Dược động học (Pharmacokinetics): nghiên cứu ảnh hưởng của cơ thể đối với thuốc (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, bài tiết thuốc tùy thuộc vào cơ thể);
•Dược lực học (Pharmacodynamics): nghiên cứu tác dụng của thuốc đối với cơ thể (tính chất, cường độ, thời gian);
•Sinh dược học (Biopharmacy): nghiên cứu các dạng của thuốc và các biện pháp nâng cao sinh khả dụng của thuốc;
•Sinh khả dụng (Bioavailabitity, F): là phần thuốc (tỷ lệ phần thuốc được hấp thu so với liều đã dùng, Fraction of dose) từ một dạng thuốc được hấp thu vào trong máu còn nguyên vẹn để cho tác dụng.
•Dược gen học (Pharmacogenetics) nghiên cứu về sự khác biệt ở cá nhân về chuyển hóa và phân bố thuốc và có liên quan đến đơn gen.
•Pharmacogenomics là gồm pharmacogenetics + sự khác biệt trong số những cá nhân liên quan đến đích tác dụng thuốc và cơ chế bệnh và có liên quan đến đa gen. Nghiên cứu mức độ phân tử của các yếu tố di truyền là xác định hiệu lực của thuốc và độc tính của thuốc.
•Tương đương sinh học (Bioequivalence): hai thuốc cùng một dạng bào chế, chứa cùng dược chất nhưng được sản xuất 2 nơi khác nhau tạo mức độ đáp ứng sinh học như nhau. Nghĩa là khi 2 thuốc này uống phải cho nồng độ thuốc đạt được trong máu hoàn toàn giống nhau.
•Sự hấp thu (Absorption): là phương thức giúp một thuốc từ bên ngoài hoặc từ một vùng nào đó trong cơ thể vào trong tuần hoàn máu, tức là cách giúp thuốc đi vào trong máu (khuyếch tán hoặc chuyển vận chủ động);
•Nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp): lượng thuốc sau khi hấp thu vào hệ tuần hoàn chứa trong huyết tương (mcg/ml; µmol/L). Sau khi dùng thuốc, định lượng nồng độ trong huyết tương và vẽ đường biểu diễn. Chỉ số này quan trọng vì có tác dụng điều trị với nồng độ chỉnh liều;
•Phân bố thuốc (Vd): sau khi hấp thu vào máu, thuốc sẽ phân bố đi khắp cơ thể nhờ sự sai biệt về nồng độ thuốc giữa máu và các mô;
•Chuyển dạng sinh học (Biotransformation): là phản ứng biến đổi cấu trúc hóa học (thường nhằm dễ tan và dễ bài tiết) nên có thể làm thay đổi hoạt tính của thuốc để loại trừ thuốc ra khỏi cơ thể;
•Bài tiết (excretion): là quá trình thuốc được loại ra khỏi cơ thể thông qua các cơ quan (thận, ruột, da, phổi), tuyến (mồ hôi, nước bọt, sữa); hai thông số cho biết tình trạng thải trừ là Cl và t1/2;
•Độ thanh thải (clearance): là thể tích huyết tương (ml) chứa thuốc được một cơ quan (gan, thận) loại bỏ hoàn toàn (lọc sạch) thuốc đó trong thời gian 1 phút; biết được Cl ấn định chế độ điều trị hợp lý, nhất là TTM
•Thời gian bán thải (Half life t1/2): là thời gian cần thiết để nồng độ thuốc trong huyết tương giảm đi một nửa so với giá trị ban đầu. Thời gian để thuốc bài xuất hoàn toàn (99%) là t1/2 x 7, biết t1/2 thì sẽ chỉ định số lần dùng thuốc trong ngày.
Vậy thì khía cạnh đo nồng độ thuốc và đánh giá mức độ kháng thuốc sốt rét thuộc phần nào ở trên. Đó chính là thuộc vào nghiên cứu dược động học (khoa học nghiên cứu số phận của thuốc khi thuốc được đưa vào cơ thể sẽ được hấp thu, phân bố, chuyển hóa và đào thải như thế nào để cho tác dụng điều trị, phòng bệnh,…và còn là bộ phận của dược lý lâm sàng trong xem xét, nghiên cứu thuốc dùng trong lâm sàng đưa đến hiệu quả điều trị và an toàn).
Kỹ thuật đo qua máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), mẫu máu tính mạch, 2ml hoặc trên giấy thấm, các bước tiến hành là thường chỉ nên lấy máu ở người trưởng thành trên 15 tuổi; áp dụng tiến hành các thuốc sốt rét có thời gian bán hủy kéo dài; thời điểm: D0, D7, D42; máu tính mạch 4ml, cho vào tube chống đông heparine, chia ra gồm các phần với các mục đích khác nhau như dưới đây:
-0.5ml vào 4.5ml guanidine, tube được code hóa;
-0.5-1ml nếu có làm test in vitro;
-Máu còn lại ly tâm 2000vòng/ phút, chắt huyết tương chia vào 2 tube đông (cryotube) đã ghi nhãn trước;
Một ví dụ điển hình là xác định nồng độ chloroquine và Desethylchloroquine trong nghiên cứu kháng thuốc nhóm chloroquine và chất chuyển hóa của chúng (desethylchloroquine) nhằm phiên giải kết quả thất bại điều trị (xuất hiện lại ký sinh trùng sốt rét trong khoảng ngày D4-D28). Thông qua bước đo lượng Chloroquine (CQ) và chất chuyển hóa chính của chloroquine là Desethylchloroquine (DCQ) trong máu vào thời điểm D2 và mẫu máu lấy ở ngày thất bại (Dthất bại), nếu nếu nồng độ CQ+DCQ ³ 100mg/ml mà có sự xuất hiện P.vivax trong máu à cho biết kháng cao với CQ;