Các thử nghiệm đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) với các thuốc chống sốt rét có vai trò hết sức quan trọng trong Chương trình phòng chống sốt rét ở bất cứ giai đoạn nào. Tuy nhiên, hiện nay tỷ lệ bệnh sốt rét có chiều hướng giảm dần, việc tìm kiếm bệnh nhân có KSTSR đủ tiêu chuẩn thử nghiệm thuốc trên lâm sàng (in vivo) trở nên hết sức khó khăn, do đó các thử nghiệm thuốc tại labô (in vitro) là hết sức cần thiết.
Để thử nghiệm thuốc tại labô vấn đề nuôi cấy P.falciparum giữ chủng ký sinh trùng đã được nghiên cứu và phát triển qua các giai đoạn:
Năm 1912 Bass và Johns đã tiến hành nuôi cấy với các chủng ký sinh trùng P.falciparum và P.vivax, môi trường nuôi cấy lúc này glucosa nên kết quả nuôi cấy đạt được rất hạn chế, KSTSR chỉ có khả năng phát triển được vài chục vòng rồi chết.
Năm 1941 với những nghiên cứu của Trager với P.lophurac, nghiên cứu của Bull và Gieman với P.knowlesi là loại KSTSR ký sinh trên khỉ. Tuy những nghiên cứu này không duy trì được sự phát triển của KSTSR tại labô, nhưng kết quả nghiên cứu đã được các chuyên gia Tổ chức Y tế thế giới đúc kết lại thành những kinh nghiệm để phát triển kỹ thuật nuôi cấy cho giai đoạn sau qua các nhận xét: P.coatnaji và P.falciparum có khả năng nhân lên khi cho một dòng chẩy chậm môi trường qua một lớp tế bào lắng dưới đáy; môi trường nuôi cấy bạch cầu RPMI 1640 của Georga Moore có Hepes buffer giúp cho KSTSR phát triển tốt, nếu tăng CO2 và giảm O2 ký sinh trùng phát triển tốt hơn.
 |
Tiếp thu kỹ thuật từ Học viện
Quân đội Úc |
Đầu năm 1976, Trager và Jensen đã tổng hợp các nhận xét và kinh nghiệm để nuôi cấy thành công P.falciparum từ máu khỉ Aotus Trivirgatus. Từ năm 1978, Jensen đã cải tiến kỹ thuật nuôi ban đầu P.falciparum dùng dòng chảy chậm môi trường RPMI 1640 qua lớp tế bào lắng bằng cách dùng một bình hút ẩm đốt nến (candle jar method) phù hợp hơn.
1.Phương pháp bình nến (candle jar method):
Mô tả kỹ thuật: một lượng dịch treo hồng cầu 6-8% trong môi trường RPMI 1640 được cho vào đĩa Petri sao cho có độ dầy từ 2-3 mm. Môi trường được thay hàng ngày bằng cách nghiêng đĩa Petri rồi dùng pipet Pasteur hút hết lớp môi trường cũ nổi ở trên (không động đến lớp hồng cầu lắng ở đáy) và thay thế bằng môi trường mới. Nồng độ 2-3% CO2 và 15-17% O2 được tạo ra trong bình bằng cách đốt một ngọn nến, chờ cho nến tắt thì đóng van khóa bình lại. Mật độ hồng cầu nhiễm từ 0,1% lên tới 5%sau 3-4 ngày hoặc có thể đạt mật độ cao hơn 5% bằng cách thay môi trường 2-3 lần trong ngày. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản và nhược điểm là phải thay môitrường hàng ngày nên một số tác giả đã cải tiến bằng cách dùng dịch treo hồng cầu thấp hơn (5%) và thay thế huyết thanh người bình thường bằng huyết thanh cuống rau thai nhi để chỉ phải thay môi trường hai ngày một lần.
Môi trường, huyết thanh và hồng cầu trong nuôi cấy liên tục P.falciparum: cho đến nay môi trường nuôi cấy P.falciparum vẫn là RPMI 1640 với Hepes buffer và 10-15% huyết thanh người. Tốt nhất nên dùng huyết thanh AB, trong nuôi cấy thì cần hồng cầu A hoặc O với cùng huyết thanh. Huyết thanh người tươi (fresh serum) bảo quản ở - 200C có thể dùng được hàng tháng, các loại huyết thanh khác của động vật (thỏ, lợn, dê, bò, ngựa…) đều có thể thay thế huyết thanh người để nuôi cấy P.falciparum nhưng kết quả thu được kém hơn. Môi trường RPMI 1640 thường dưới dạng bột đóng gói hoặc lọ 10,4 g với glucose pha trong 900 ml nước cất 2 lần, thêm 5,94 g hepes rồi cho thêm nước cất 2 lần cho đủ 960 ml. Lọc vô trùng qua màng lọc millipor (millipor filter) có đường kính 0,22-0,45 mm, có thể điều chỉnh độ pH bằng NaHCO3 5%. Nuôi ký sinh trùng ở môi trường có pH khoảng 7,3-7,5. Hồng cầu người để nuôi cấy P.falciparum lấy từ người cho máu, chống đông bằng ACD hoặc CPD (citrat-phosphat dextrose) có thể sử dụng được từ 3-4 tuần trong điều kiện bảo quản ở 4 0C. Hồng cầu chuẩn bị để nuôi cấy được li tâm và rửa 2 lần với môi trường không có huyết thanh, lần thứ 3 với môi trường giàu huyết thanh; mỗi lần rửa hút bỏ lớp dịch nổi ở trên. Sau lần rửa thứ ba, hồng cầu được pha thành dịch treo tùy theo yêu cầu 5%, 8% hoặc 10% trong môi trường có huyết thanh; sau đó chia thành từng lọ nhỏ đã vô trùng để tủ lạnh.
2.Phương pháp giữ chủng P.falciparum ở nhiệt độ thấp:
Để có nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu sốt rét đòi hỏi phải xây dựng một Bank ký sinh trùng, hơn nữa qua quá trình nuôi cấy liên tục P.falciparum có hiện tượng thay đổi đặc tính sinh học khi duy trì nuôi cấy lâu dài tại labô; do đó Row và cộng sự đã cải tiến đưa hồng cầu nhiễm P.falciparum vào đông lạnh sau khi li tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, phần lắng cặn hồng cầu còn lại được thêm vào một lượng tương đương chất bảo quản bằng cách cho 14 ml glycerol vào 1,512 g sorbitol pha trong NaCl 0,9% 36 ml và lọc vô trùng qua màng lọc millipor 0,45 mm; sau đó phần lắng hồng cầu có chất bảo quản được đưa vào các tube có nắp, mỗi tube khoảng 1-1,5 ml ghi địa chỉ ngày/tháng/năm rồi cho vào bình chứa nitơ lỏng hoặc đá khô (dry-ice).
Ký sinh trùng được lấy từ nitơ lỏng nuôi cấy trở lại bằng cách làm tan nhanh trong nước ấm 370C trong 2-3 phút, rồi chuyển sang tube li tâm (loại đáy nhọn có nắp), li tâm 2000 vòng/5 phút; hút bỏ dịch nổi ở trên, cho sorbitol 27% tỷ lệ 1/1 nhẹ để tránh vỡ hồng cầu. Tiếp tục Ly tâm 2000 vòng/5 phút và hút dịch nổi ở trên, cho sorbitol 5% tỷ lệ 1/1. Thêm 2 lần môi trường không huyết thanh và tiến hành như trên. Cuối cùng cho môi trường giàu huyết thanh (10-15%) tỷ lệ 1/1, ly tâm hút dịch nổi ở trên. Treo hồng cầu bằng RPHS (môi trường đầy đủ có huyết thanh), đưa vào nuôi cấy với dịch treo 4-5% cho vào đĩa Petri, mỗi đĩa 1,5 ml Þ đưa vào bình nến nuôi và thay môi trường hàng ngày theo phương pháp bình nến.
3.Ứng dụng nuôi cấy ở labô:
 |
Giữ chủng KST sốt rét trong bình
Nitơ lỏng |
Việc nuôi cấy liên tục ký sinh trùng ở labô nhằm ứng dụng để đánh giá khả năng nhậy hoặc kháng thuốc sốt rétin vitro và thử tác dụng của các loại thuốc chống sốt rét mới, chẩn đoán miễn dịch và sinh học phân tử…
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn mới tiến hành nuôi cấy trong vòng 5 năm gần đây sau khi học hỏi và tiếp thu kỹ thuật từ Học Viện Sốt rét Quân đội Australia (AAMI), Khoa Nghiên cứu sốt rét-Bệnh Viện Chợ rẫy-TP. Hồ chí Minh vàViện Sốt rét-KST-CT Trung ương. Việc nuôi cấy liên tục được tiến hành trên cơ sở các chủng thuần được các Viện nghiên cứu cung cấp và thu thập KSTSR từ thực địa. Kết quả nuôi cấy trong những năm qua mới chỉ đạt được ở phân lập P.falciparum đã được thuần chủng (F25) do Bệnh viện Chợ Rẫy cung cấp được duy trì ổn định và phát triển tốt, cung cấp nguồn kháng nguyên cho nghiên cứu miễn dịch và sinh học phân tử. Tuy nhiên tỷ lệ thành công từ các chủng thu thập từ thực địa rất thấp do khó phát triển trong điều kiện labô nên vấn đề ứng dụng thử thuốc hiện nay vẫn hết sức khó khăn; nguyên nhân có thể do thiếu kinh nghiệm nuôi cấy và điều kiện môi trường bảo quản chưa được tốt.
Cuối năm 2006, Viện sẽ có sự hợp tác đa phương với Học Viện Sốt rét Quân đội Australia và Viện vệ sinh phòng dịch Quân đội Việt Nam về lĩnh vực này sẽ là dịp học hỏi kinh nghiệm và thực hành để kỹ thuật nuôi cấy được hoàn thiện hơn. Hy vọng trong năm đến các ứng dụng nuôi cấy liên tục KSTSR sẽđáp ứng được các nhu cầu nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu đánh giá về lâm sàng điều trị ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên.
!important;