TRUYỀN HÌNH GIÁO DỤC

Đọc nhiều nhất

Plasmodium cynomolgi - Thận trọng với sự gia tăng loài ký sinh trùng sốt rét lây truyền từ khỉ sang người (Phần 1)
1
Cập nhật Hướng dẫn giám sát, theo dõi và đánh giá chương trình sốt rét (Phần 1)
2
Cập nhật Hướng dẫn giám sát, theo dõi và đánh giá chương trình sốt rét (Phần 2)
3
Cập nhật thông tin về đường lan truyền và gánh nặng của một số bệnh do ngoại ký sinh trên thế giới (còn nữa)
4
Phiếu Yêu cầu báo giá số 586
5
Bảng Công bố cơ sở Y tế đáp ứng yêu cầu là cơ sở thực hành trong đào tạo khối ngành sức khỏe số 570
6

0001542548
Đang online:	141
Hôm nay :	657
Hôm qua :	5,793
Tuần này :	6,450
Tuần trước :	84,827
Tháng này :	28,169
Tháng trước:	373,129

Xác định cấu trúc & đa dạng di truyền quần thể Plasmodium malariae tại khu vực cận sa mạc sahara, châu phi từ biến thể microsatellite và đa hình đơn nucleotide liên kết trong các gen kháng thuốc sốt rét tương đồng (Phần 2)

Thứ tư, 7/5/2025, 21:28 , Lượt đọc : 110

Giải trình tự amplicon mục tiêu các gen kháng thuốc sốt rét

Mười một gen của P. malariae tương đồng với các gen kháng thuốc sốt rét của P. falciparum đã được khuếch đại và giải trình tự (Bảng 2). Các mồi đặc hiệu đã được thiết kế riêng cho từng gen và các điều kiện tối ưu để khuếch đại bằng enzyme Q5 polymerase (New England Biolabs) được trình bày trong Bảng 3. Các sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng gel agarose 1% và tất cả amplicon từ mỗi mẫu đã được gộp lại để chuẩn bị thư viện giải trình tự sâu, sử dụng bộ dụng cụ TruSeq HT library prep. Thư viện được làm sạch bằng bộ dụng cụ tinh sạch PCR Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ và kích thước amplicon được đo bằng máy Qubit fluorometer (In vitrogen, Carlsbad, CA, Mỹ) và hệ thống Tapestation (Agilent).

Quá trình giải trình tự hai chiều theo cặp (paired-end sequencing) được thực hiện trên hệ thống MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) với nồng độ 10 pM của các amplicon đã gộp, tại nền tảng genomics của MRCG, sử dụng bộ thuốc thử Illumina v2 để tạo ra các đoạn đọc (reads) dài 250 bp mỗi đầu, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 2. Danh mục các gen kháng thuốc sốt rét tương đồng P. malariae đã được giải trình tự

S/N	Gen kháng thuốc chống sốt rét	Viết tắt	PlasmoDB ID
1	Amino acid transporter AAT1, putative	Pmaat1	PmUG01_11034100
2	AP-2 complex subunit mu, putative	Pmap2mu	PmUG01_14053100
3	Non-SERCA-type Ca²⁺-transporting P-ATPase, putative	Pmatp4	PmUG01_13021900
4	Calcium-transporting ATPase, putative	Pmatp6	PmUG01_02017400
5	Bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase	Pmdhfr	PmUG01_05034700
6	Hydroxymethyldihydropterin pyrophosphokinase-dihydropteroate synthase, putative	Pmdhps	PmUG01_14045500
7	Kelch protein K13, putative	Pmkelch13	PmUG01_12021200
8	Multidrug resistance protein 1, putative	Pmmdr1	PmUG01_10021600
9	Sodium/hydrogen exchanger, putative	Pmnhe	PmUG01_14020100
10	Chloroquine resistance transporter, putative	Pmcrt	PmUG01_01020700
11	Cytochromeb, putative	Pmcytb	PmUG01_MIT001100

Bảng 3. Điều kiện tối ưu để tạo ra các amplicon kháng thuốc của P. malariae

TT	Mồi	Trình tự	Kích thước Amplicon (bp)	Mồi (µM)	MgCl₂ (mM)*	dNTP (mM)	Thời gian kéo dài (s)	Tm (°C)
1	Pm_AAT1_F	AAATGGGTCAGTAGCCGCCTATG	1708	0.5	2.0	0.2	90	68
2	Pm_AAT1_R	ATCAGTTTGCGATTCATGTGTGCT	1708	0.5	2.0	0.2	90	68
3	Pm_CRT_F	AAAGTGACACACCTTATAGAGACC	729	0.5	2.0	0.2	90	66
4	Pm_CRT_R2	GCGAAGAACTGAAGCCCAAAA	729	0.5	2.0	0.2	90	66
5	Pm_AP2mu_F	CCGTTTCGACAAGAAGTAATTC	1527	0.5	2.0	0.2	90	62
6	Pm_AP2mu_R	ACATACCACTGGAGGTAAACATAG	1527	0.5	2.0	0.2	90	62
7	Pm_ATP4_F	AACAAGAGAATCGTCTGAAAGG	3823	0.3	2.0	0.2	90	62
8	Pm_ATP4_R	AGCCCATGAAATGCCAAAGAGATA	3823	0.3	2.0	0.2	90	62
9	Pm_ATP6_F	TGACTGGGGAATCTTGTTCA	3699	0.5	3.0	0.7	90	62
10	Pm_ATP6_R	TCAATAATGATAACAGGAAAAGACCA	3699	0.5	3.0	0.7	90	62
11	Pm_CYTB_F	ACATGGTAGCACTAATCCTTTAGG	585	0.5	2.0	0.2	90	63
12	Pm_CYTB_R	CAGAAATATCGTCTTATCGTAGCC	585	0.5	2.0	0.2	90	63
13	Pm_DHFR_F	TATGCCATCTGCGCTTGCT	1811	0.3	2.0	0.2	90	62
14	Pm_DHFR_R	TTATCATGGTGCACGTAATTTTG	1811	0.3	2.0	0.2	90	62
15	Pm_DHPS_F	ATACGAAACCGTCCCGGAGT	1897	0.5	2.0	0.2	90	68
16	Pm_DHPS_R	ACTGTACGAGGCAATGGCTAATCC	1897	0.5	2.0	0.2	90	68
17	Pm_Kelch13_F	CTGTCACGTATGATAGAGAATCC	2089	0.5	2.0	0.2	90	63
18	Pm_Kelch13_R	ATCAGCACAGAATGCCCAAATCTT	2089	0.5	2.0	0.2	90	63
19	Pm_MDR1_F	TATGTGCAACAATATCAGGAGG	4168	0.3	2.0	0.2	90	62
20	Pm_MDR1_R	ATACCATCCTGTTCTGCAAGTAGC	4168	0.3	2.0	0.2	90	62
21	Pm_NHE_F	TTTAGCAAACCTGGGCAGTTCTTG	4988	0.5	3.0	0.7	120	67
22	Pm_NHE_R	GTTAGCAATAGTCCATTGGCTGC	4988	0.5	3.0	0.7	120	67

Bộ đệm enzyme Q5 Polymerase có sẵn 2.0 mM MgCl₂.

PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

Phân tích microsatellite hoặc SSR (Simple Sequence Repeat)

Các alen microsatellite đã được phân nhóm được nhập dưới dạng đối tượng genind vào phần mềm thống kê R (Phiên bản 4.1.13) và được sử dụng để phân tích di truyền quần thể. Ban đầu, các quần thể được xác định là các quốc gia mà từ đó các bản phân lập được thu thập. Đa dạng di truyền ở mức độ quần thể được đánh giá dựa trên dị hợp tử kỳ vọng và số lượng alen trên mỗi locus (tức là sự phong phú alen). Giá trị dị hợp tử kỳ vọng dao động từ 0 đến 1 (0 cho thấy không có sự đa dạng và 1 cho thấy tất cả các alen là khác nhau). Các thông số đa dạng như kiểu gen đa locus quan sát được và kỳ vọng, chỉ số đa dạng kiểu gen đa locus Shannon-Wiener, chỉ số đa dạng Stoddart và Taylor của kiểu gen đa locus, chỉ số Simpson, đa dạng gen không sai lệch của Nei và sự đồng đều đã được tính toán bằng hàm “poppr” trong R.

Khoảng cách di truyền cặp đôi của Bruvo được tính toán bằng các chỉ điểm microsatellite cho tất cả bản phân lập sử dụng lệnh “bruvo.dist” trong R và được hiển thị dưới dạng bản đồ nhiệt phân cấp. Để xác định cấu trúc quần thể, số lượng cụm di truyền tối ưu ban đầu được xác định bằng cách chạy K-means liên tiếp với các giá trị k tăng dần và so sánh các giải pháp phân cụm khác nhau sử dụng Tiêu chí Thông tin Bayesian (Bayesian Information Criterion BIC) trong phần mềm R.

Ngoài ra, hàm ‘find.clusters’ trong gói adegenet của R (phiên bản 2.0) được sử dụng để gắn từng cá thể vào các cụm di truyền. Phân tích phân biệt các thành phần chính (DAPC) được áp dụng để mô tả các cụm của các cá thể có liên quan di truyền và được hiển thị bằng biểu đồ phân tán. DAPC chuyển đổi dữ liệu bằng phương pháp phân tích thành phần chính (PCA), sau đó thực hiện phân tích phân biệt trên các thành phần chính được giữ lại bằng phương pháp kiểm tra chéo. Tổ tiên đã được xác định bằng mô hình admixture sử dụng phần mềm STRUCTURE phiên bản 2.3.4, với các cá thể được gắn vào các quần thể K dựa trên kiểu gen đa locus của chúng.

Giá trị K kỳ vọng được đặt từ 1 đến 9 và STRUCTURE được chạy với 100.000 lần lặp MCMC trong 10.000 chu kỳ Burn-in. Giá trị K thích hợp nhất được xác định bằng ΔK được tính toán và triển khai trên công cụ Structure Harvester Web v0.6.94. Phân bố tỷ lệ tổ tiên sau đó được hiển thị dưới dạng biểu đồ cột.

Phân tích trình tự gen kháng thuốc ứng viên mục tiêu và SNP

Chất lượng của các tệp Fastq thu được được kiểm tra bằng phần mềm FASTQC, sau đó cắt gọn và lọc để loại bỏ các đoạn kém chất lượng và chỉ số không mong muốn. Các đoạn đọc được xử lý như minh họa trong Hình 1 - các đoạn đọc hoặc được ánh xạ (mapping) trực tiếp vào bộ tham chiếu của các gen đích được ghép nối từ PLASMODB, hoặc được lọc để loại bỏ dữ liệu bị thiếu trước khi ánh xạ vào bộ tham chiếu, hoặc được xử lý qua quy trình khử nhiễu (dada2 phiên bản 1.16.0) trước khi thực hiện lọc và ánh xạ tham chiếu. Quá trình lọc dữ liệu thiếu được thực hiện qua ba bước:

(i) Mẫu có hơn 80% dữ liệu thiếu bị loại khỏi tập dữ liệu gốc;

(ii) Locus có hơn 70% dữ liệu thiếu từ tập dữ liệu thu được sau bước lọc đầu tiên (lọc 1) bị loại bỏ;
(iii) Mẫu có hơn 40% dữ liệu thiếu từ tập dữ liệu thu được sau bước lọc thứ hai (lọc 2) cũng bị loại bỏ;
Chi tiết được tóm tắt trong Bảng bổ sung 1.

P. malariae raw reads: Các đoạn đọc thô của P. malariae; P. malariae reads -trimmed and filtered: Các đoạn đọc P. malariae-đã cắt tỉa và lọc; P. malariae reads-poor quality: Các đoạn đọc P. malariae - chất lượng kém; Mapped to reference (BWA/BOWTIE): Ánh xạ với bộ tham chiếu (BWA/BOWTIE); Filtered for missingness (R script): Lọc thiếu dữ liệu (R script); Variant calling (BCFtools/Freebayes): Gọi biến thể (BCFtools/Freebayes); Denoising (Dada2 V1.16.0): Khử nhiễu (Dada2 V1.16.0)

Hình 1. Quá trình phân tích trình tự amplicon

Các đoạn đọc được ánh xạ kết hợp hoặc không kết hợp bằng cả BWA và BOWTIE riêng biệt. Việc gọi biến thể từ từng tệp bam được thực hiện bằng cả BCFtools và freebayes. Các tệp vcf thu được từ quá trình gọi biến thể được so sánh để xác định các SNP phù hợp và được chọn để phân tích tiếp theo. Để xác định cấu trúc của các mẫu phân lập từ SNP, áp dụng phương pháp DAPC như mô tả ở trên và hai tọa độ đầu tiên được trực quan hóa trên biểu đồ phân tán.

Sự khác biệt cặp đôi giữa các quần thể về SNP kháng thuốc tương đồng của P. malariae được so sánh dựa trên khoảng cách di truyền của Nei và được biểu diễn dưới dạng bản đồ nhiệt phân cấp. Độ phức tạp di truyền dựa trên SNP trong các mẫu (độ phức tạp hoặc tính đa nhiễm) được đánh giá thông qua hệ số cận huyết của Wright (Fws). Thước đo FWS (có giá trị từ 0 - 1) là một chỉ số về đa dạng di truyền trong vật chủ, mô tả mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của một nhiễm trùng cá thể so với sự đa dạng di truyền của quần thể KSTSR. Giá trị FWS thấp cho thấy sự đa dạng di truyền cao trong vật chủ so với quần thể. Mức độ liên kết mất cân bằng (linkage disequilibrium - LD) giữa các SNP ở các mục tiêu kháng thuốc tương đồng cũng được xác định và biểu diễn bằng gói LDheatmap của R.

(còn nữa)

CN. Nguyễn Thái Hoàng & TS.BS. Huỳnh Hồng Quang

Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn

Tin cùng chuyên mục

Nhân một trường hợp tái xuất hiện Plasmodium malariae sau điều trị: tái phát gần hay tái nhiễm?

30/9/2025Ký sinh trùng sốt rétPlasmodium malariae là loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) bị lãng quên nhiều nhất trong 5 loài KSTSR gây bệnh ở người và hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa hiểu rõ cơ chế nào đứngđằng sau khả năng tiềm ẩn lâu dài của loài P. malariae này trong cơ thể người bệnh

Đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp tỷ lệ mắc và tử vong toàn cầu của sốt rét ác tính do Plasmodium malariae (tiếp theo và hết)
16/9/2025Ký sinh trùng sốt rétSau quá trình tìm kiếm các nghiên cứu có liên quan, tổng cộng 1835 nghiên cứu đã được thu thập. Trong số này, 236 nghiên cứu trùng lặp đã bị loại bỏ. Tiếp theo, 1599 nghiên cứu được sàng lọc qua tiêu đề và tóm tắt, dẫn đến việc loại trừ 1273 nghiên cứu, bao gồm: 677 bài báo không liên quan đến P. malariae, 89 sách và chương sách, 24 báo cáo hội nghị, 39 bài xã luận, thư từ, bài trao đổi, 39 bài ghi chú và 444 bài tổng quan.
Đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp tỷ lệ mắc và tử vong toàn cầu của sốt rét ác tính do Plasmodium malariae (còn nữa)
15/9/2025Ký sinh trùng sốt rétCác biến chứng nghiêm trọng ở bệnh nhân nhiễm Plasmodium malariae (P. malariae) là rất hiếm. Đây là nghiên cứu đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đầu tiên cho thấy tỷ lệ mắc và tử vong toàn cầu do sốt rét ác tính P. malariae ở người.
Xác định cấu trúc & đa dạng di truyền quần thể Plasmodium malariae tại khu vực cận sa mạc sahara, châu phi từ biến thể microsatellite và đa hình đơn nucleotide liên kết trong các gen kháng thuốc sốt rét tương đồng (Phần 3-Hết)
8/5/2025Ký sinh trùng sốt rét
Xác định cấu trúc & đa dạng di truyền quần thể Plasmodium malariae tại khu vực cận sa mạc sahara, châu phi từ biến thể microsatellite và đa hình đơn nucleotide liên kết trong các gen kháng thuốc sốt rét tương đồng (Phần 1)
5/5/2025Ký sinh trùng sốt rét

Chia sẻ tin bài