Plasmodium malariae, một ký sinh trùng sốt rét ở người ít được quan tâm, song chiếm tới 10% số ca nhiễm sốt rét tại khu vực cận sa mạc Sahara châu Phi (sSA). Mặc dù nhiễm P. malariae thường được coi là không nghiêm trọng về mặt lâm sàng, nhưng loài ký sinh trùng này chủ yếu xuất hiện trong các trường hợp đồng nhiễm với P. falciparum - là một loài ký sinh trùng chiếm ưu thế hơn. Việc hoàn thành giải trình tự bộ gen tham chiếu của P. malariae đã mở ra cơ hội nghiên cứu sâu hơn về khía cạnh sinh học của nó và sự tương tác với cơ thể người, bao gồm cả phản ứng đối với các biện pháp can thiệp phòng chống sốt rét. Các nhà khoa học đã phân tích 75 mẫu phân lập P. malariae từ 7 quốc gia lưu hành sốt rét tại khu vực sSA, sử dụng các microsatellite có độ biến dị cao. Các ca nhiễm P. malariae cho thấy sự đa dạng di truyền lớn, với năm nhóm quần thể phụ có nguồn gốc từ ba tổ tiên khác nhau (không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của mẫu bệnh phẩm). Trình tự của 11 gen tương đồng liên quan đến kháng thuốc sốt rét đã xác định các đa hình đơn nucleotide (SNP) với tần suất thấp, cùng với sự mất cân bằng liên kết mạnh giữa các locus, có thể do áp lực chọn lọc từ thuốc chống sốt rét. Từ dữ liệu SNP đã được tinh chỉnh, phần lớn từ vùng mã hóa cytochrome b (Cytb) của ty thể, ít nhất ba quần thể phụ đã được phát hiện. Bằng chứng về sự đa dạng và áp lực chọn lọc này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc đưa P. malariae vào các chương trình giám sát bộ gen sốt rét, nhằm cải thiện các công cụ và chiến lược hướng tới mục tiêu loại trừ sốt rét.
Sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của các mầm bệnh ở người, thường được xác định thông qua phương pháp xác định kiểu gen phân tử, là một công cụ hữu ích để theo dõi các mô hình lây truyền ở cấp độ địa phương và khu vực cũng như đánh giá tác động của các biện pháp can thiệp y tế cộng đồng. Cấu trúc quần thể của các loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) chính được cho là chịu ảnh hưởng bởi sự cách biệt địa lý, sự di dân của con người, cường độ lan truyền sốt rét và áp lực chọn lọc từ thuốc cũng như các biện pháp can thiệp kiểm soát vector truyền bệnh. Việc hiểu rõ sự phân bố của các KSTSR, đặc biệt là các dấu hiệu kháng thuốc tiềm năng trong các khu vực lưu hành, sẽ cung cấp thêm thông tin phục vụ việc thiết kế các chiến lược kiểm soát và loại trừ sốt rét. Những kiến thức này thường tập trung vào hai loài chính ở người là P. falciparum và P. vivax, trong khi các loài khác như P. malariae lại ít được quan tâm hơn.
Một số nghiên cứu hạn chế về sự đa dạng di truyền của P. malariae tại khu vực cận sa mạc Sahara, châu Phi đã ghi nhận sự đa dạng di truyền cao của loài ký sinh trùng này tại các vùng lưu hành khác nhau, tuy nhiên không phát hiện cấu trúc quần thể hoặc sự khác biệt đáng kể nào. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào các ca nhiễm tại các địa điểm không cách nhau quá xa, chẳng hạn như hai ngôi làng lưu hành ở Malawi cách nhau khoảng 100 km. Với việc mở rộng nguồn thu thập mẫu từ các khu vực khác nhau trên khắp khu vực cận sa mạc Sahara, châu Phi và sử dụng thêm các chỉ điểm di truyền trung lập, chúng ta có thể nhìn nhận một góc nhìn toàn diện hơn về sự đa dạng của loài ký sinh trùng này.
Phân tích đặc hiệu các locus gen cũng đã được nghiên cứu nhằm mô tả các quần thể P. malariae. Các biến thể di truyền trong các protein kháng nguyên của P. malariae gồm protein ẩn danh liên quan đến thrombospondin (TRAP), kháng nguyên màng đỉnh 1 (AMA1) và protein 6-cysteine (P48/45) đã được báo cáo tại châu Á (Thái Lan, Myanmar và Lào)⁴. Kết quả cho thấy sự đa dạng đột biến cao trong gen trap và ama1 của P. malariae so với p48/45, với phần lớn là các đột biến không đồng nghĩa (non-synonymous), cho thấy sự đa dạng di truyền trong các gen này được duy trì bởi áp lực chọn lọc phân hóa⁴. Tương tự, các đột biến không đồng nghĩa mới đã được quan sát tại các vị trí đa hình của gen dhfr, dẫn đến việc mô tả sáu allele DHFR mới có liên quan đến kháng sulfadoxine-pyrimethamine (SP)⁵. Điều này cũng được khẳng định qua các phân tích trình tự toàn bộ hệ gen P. malariae gần đây, ghi nhận 4 đột biến đồng nghĩa và 7 đột biến không đồng nghĩa trong một số gen đồng phân “ortholog” liên quan đến kháng thuốc⁶. Tất cả các nghiên cứu này đều cho thấy sự đa dạng cao trong loài ký sinh trùng P. malariae cũng như hiện tượng tái tổ hợp và luân chuyển gen thường xuyên giữa các quần thể. Để điều tra sâu hơn, chúng tôi đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của P. malariae tại bảy quốc gia lưu hành bệnh ở vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi, sử dụng các locus microsatellite có tính đa hình cao và mô tả các đột biến SNP trong các gen tương đồng (orthologous genes) liên quan đến kháng thuốc sốt rét ở P. falciparum.
Mẫu P. malariae
Các mẫu máu lưu trữ tại Đơn vị Hội đồng Nghiên cứu Y học Gambia (Medical Research Council Unit the Gambia - MRCG) và từ các cộng tác viên trong Mạng lưới đa dạng mầm bệnh châu Phi (Pathogen Diversity Network Africa - PDNA) đã được tiếp cận sau khi có sự đồng thuận chung và sự cho phép về mặt Y đức. Các mẫu máu bị nhiễm P. malariae được phân tích đến từ 7 quốc gia thuộc vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi nơi có các điều kiện lan truyền sốt rét khác nhau cùng với các đặc điểm sử dụng và kháng thuốc chống sốt rét khác nhau (Bảng 1).
Các mẫu được xử lý bao gồm giọt máu khô hoặc DNA đã được chiết xuất sẵn, ngoại trừ các mẫu từ Nigeria, nơi sử dụng hồng cầu bị loại bỏ bạch cầu. DNA được chiết xuất bằng bộ kit QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Đức) trước khi tiến hành chẩn đoán PCR thời gian thực để xác nhận nhiễm P. malariae theo phương pháp đã được mô tả trước đó7. Tổng cộng 75 trường hợp nhiễm P. malariae được xác nhận (phần lớn đồng nhiễm với P. falciparum qua phân tích qPCR) đã được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền, như trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1. Sự phân bố của các mẫu P. malariae từ các quốc gia lưu hành bệnh
| TT | Quốc gia | Vùng | Năm thu thập | Loại mẫu | Bối cảnh lan truyền | Thuốc sốt rét đã dùng | Mẫu P. malariae |
| 1 | Nigeria | Tây Phi | 2017 | Hồng cầu loại bỏ bạch cầu | Cao | AL | 18 |
| 2 | Tanzania | Đông Phi | 2009–2017 | Giọt máu khô | Vừa | AL | 19 |
| 3 | Burkina Faso | Tây Phi | 2014–2015 | DNA | Cao | ASAQ/DHAP/AP | 17 |
| 4 | Mali | Tây Phi | 2017 | Giọt máu khô | Cao | AL | 9 |
| 5 | Guinea | Tây Phi | 2014 | Giọt máu khô | Cao | AL | 4 |
| 6 | Cameroon | Trung Phi | 2015 | Giọt máu khô | Cao | ASAQ/AL | 4 |
| 7 | Ghana | Tây Phi | 2017 | DNA | Vừa | AL/ASAQ | 3 |
| 8 | Không biết | Đông Nam Á | Không biết | Giọt máu khô | Không biết | Không biết | 1 |
AL Arthemeter-Lumefantrine, ASAQ Artesunate-Amodiaquine, DHAP Dihydroartemisin piperaquine), AP Artesunate-Pyronaridine.
Khuếch đại microsatellite và phân tích đoạn gen
Xác định kiểu gen đa locus của P. malariae được thực hiện thông qua việc sử dụng 5 microsatellite có độ khác biệt cao (Pm_02, Pm_09, Pm_11, Pm_34 và Pm_47) trong phản ứng PCR bán lồng (semi-nested), như đã được mô tả trước đây. Quá trình khuếch đại ban đầu bao gồm 3µL DNA của P. malariae trong một phản ứng 15 µL, sử dụng 1× dung dịch đệm Thermopol (New England Biolabs), MgCl2 ở nồng độ 1,5 mM, 0,6 U Taq Polymerase (New England Biolabs), 0,8 mM dNTPs và 0,05 μM mồi xuôi và mồi ngược. Cùng điều kiện này được áp dụng cho phản ứng bán lồng, sử dụng 2 μL sản phẩm khuếch đại ban đầu trong phản ứng 35 µL với nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 0,1 μM.
Điều kiện chu kỳ cho quá trình khuếch đại ban đầu bao gồm: biến tính ban đầu trong 4 phút ở 94°C, tiếp theo là 35 chu kỳ biến tính trong 30 giây ở 94°C, gắn mồi ở 48°C trong 30 giây, kéo dài ở 68°C trong 60 giây, và kéo dài cuối cùng trong 2 phút ở 68°C. Cùng điều kiện chu kỳ này được áp dụng cho phản ứng bán lồng, ngoại trừ nhiệt độ gắn mồi là 52°C và tổng số chu kỳ là 20. Sản phẩm PCR microsatellite được tách trên máy giải trình tự mao quản 3730 (Applied Biosystems) sau khi pha loãng (1:50 - 1:100) và trộn các locus đã được đánh dấu và định cỡ khác nhau sau khi khuếch đại. Việc phân tích các biểu đồ điện di được thực hiện bằng phần mềm Geneious Prime phiên bản 2022.0.1 (http://www.geneious.com), và các allele được tự động định cỡ bằng cách so sánh với thang chuẩn kích thước HD400 (Applied Biosystems).
(còn nữa)
CN. Nguyễn Thái Hoàng & TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn