Tổng quan về lịch sử kính hiển vi
Từ kính hiển vi có tên Microscop trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “người nhìn thấy những vật nhỏ” (tên tiếng Anh là Microscopy và tiếng Pháp là Microscopie). Thiết bị này dùng để nhìn những vật rất bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Thường thì nếu bạn càng để gần mắt một vật thì bạn càng thấy nó rõ hơn nhưng nếu bạn để nó cách mắt 25cm thì lại nhìn không rõ khi đó người ta nói rằng nó không thuộc tiêu cự. Điều gì sẽ xảy ra nếu như chúng ta để vào giữa mắt và vật đó một miếng kính lồi khi đó vật đó sẽ ở gần mắt hơn 25cm và sẽ ở trong tiêu cự. Ngày nay chúng ta mô tả hiện tượng này thật là đơn giản như là việc sử dụng kính lúp. Những chiếc kính lúp thực ra là tiền thân của những chiếc kính hiển vi (KHV) đơn giản.
Những chiếc KHV đơn giản ấy đã có từ thời xa xưa nhưng ở đây chúng ta muốn đề cập đến những chiếc KHV phức tạp. Vậy những chiếc KHV phức tạp là gì? Nhờ hai thấu kính, vật quan sát được nhân ảnh lên gấp hai lần, một trong hai thấu kính đó được gọi tên là vật kính, nó phóng đại hình ảnh lên lần thứ nhất, thấu kính thứ hai được gọi là thị kính phóng đại hình ảnh lên lần thứ hai. Thực ra, trước đây KHV có vài thấu kính vừa được sử dụng như thị kính, vừa để dùng như vật kính nhưng điều quan trọng là tất cả các loại KHV này hoạt động dựa trên nguyên tắc phóng đại kép. Chiếc KHV phức tạp đầu tiên được thiết kế và ra đời cách nay 500 năm, vào khoảng giữa những năm 1510 và 1610. Người ta không biết đích xác ai là tác giả của nó nhưng rất nhiều người cho rằng bản quyền sáng chế KHV thuộc về Galilê. Đôi khi người ta gọi nhà khoa học người Đan Mạch Lêvenguc là ông tổ của KHV nhưng không phải vì ông là người sáng chế ra nó mà vì ông đã phát minh ra rất nhiều thứ, có sự giúp đỡ của KHV. Lêvenguc đã chỉ ra rằng những con mọt, những con bọ chó và những sinh vật nhỏ bé khác nở ra từ trứng không phải là các loài có khả năng tự sinh sản, ông là người đầu tiên đã nhìn thấy qua KHVcác dạng của sự sống như: những cơ thể đơn bào và vi khuẩn. Bằng chính đôi bàn tay mình, ông đã chế tạo ra một chiếc KHV và qua chiếc KHV đó ông đã nhìn thấy toàn bộ quá trình tuần hoàn của sự sống. Ngày nay, con người trong mọi lĩnh vực khoa học và công nghiệp đều không thể làm việc được nếu thiếu KHV (Xem hình bên là chiếc kính hiển vi phức hợp do John Cuff chế tạo năm 1750)
Những KHV đầu tiên quan sát vật thể nhỏ bé bằng ánh sáng, sử dụng các thấu kính quang học hay gương quang học để tăng độ phóng đại của hệ quang học, chúng được gọi là KHV quang học. Ngày nay, có nhiều phương pháp khác không sử dụng ánh sáng để quan sát các vật thể nhỏ bé và các KHV thuộc những loại này có tên gọi đặc trưng cho từng phương pháp quan sát.
Cấu tạo chung của kính hiển vi
+ Chân kính.
+ Thân kính gồm: gồm ống kính (chứa thị kính, đĩa quay gắn các vật kính và vật kính); ốc điều chỉnh (cả ốc đạo cấp và ốc vi cấp)
+ Bàn kính: nơi đặt tiêu bản để quan sát.
+ Ngoài ra, còn có gương phản chiếu ánh sáng để tập trung ánh sáng vào vật mẩu.
Kính hiển vi điện tử truyền qua TECNAI T20 ở Khoa Vật lý và Thiên văn, Đại học Glasgow
Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi
Kính hiển vi quang học
Từ trước đến nay có xuất hiện nhiều loại KHV với nhiều tính năng khác nhau, song trước hết phải kể đến KHV quang học sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát các vật nhỏ, do đó độ phân giải của KHV này giới hạn bởi bước sóng ánh sáng khả kiến, và không thể cho phép nhìn thấy các vật có kích thước nhỏ hơn. Một điện tử chuyển động với vận tốc (V), sẽ có xung lượng p = m0.v, và nó tương ứng với một sóng có bước sóng cho bởi hệ thức de Broglie:
Ta thấy rằng bước sóng của điện tử nhỏ hơn rất nhiều so với bước sóng ánh sáng khả kiến nên việc sử dụng sóng điện tử thay cho sóng ánh sáng sẽ tạo ra thiết bị có độ phân giải tốt hơn nhiều kính hiển vi quang học.
Năm 1931, lần đầu tiên Ernst August Friedrich Ruska cùng với một kỹ sư điện là Max Knoll lần đầu tiên dựng nên mô hình KHV điện tử truyền qua đơn giản, sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh của các sóng điện tử. Thiết bị thực sự đầu tiên được xây dựng vào năm 1938 bởi Albert Presbus và James Hillier (1915-2007) ở Đại học Toronto (Canada) là một thiết bị hoàn chỉnh thực sự. Nguyên tắc tạo ảnh của KHV điện tử TEM gần giống với KHV quang học, điểm khác quan trọng là sử dụng sóng điện tử thay cho sóng ánh sáng và thấu kính từ thay cho thấu kính thủy tinh.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử (Electron Microscopy) là một thiết bị dùng để nghiên cứu cấu trúc, vi cấu trúc của vật chất, dùng phổ biến trong vật lý, công nghệ, y sinh học. Hiện nay, một xu hướng mới của khoa học là công nghệ nano thì KHV điện tử lại là một dụng cụ không thể thiếu của công nghệ này. Bài viết sau trình bày một cách khái quát về KHV điện tử (cấu tạo, nguyên lý hoạt động và một số hình ảnh). Tiếp đó, một thế hệ của KHV điện tử chính là KHV điện tử truyền qua (TEM) có quét hoặc không quét ảnh.
Đối tượng sử dụng của TEM là chùm điện tử có năng lượng cao, vì thế các cấu hình, linh kiện chính của TEM được đặt trong cột chân không siêu cao được tạo ra nhờ các hệ bơm chân không (bơm turbo, bơm iôn..).
Súng phóng điện tử
Trong TEM, điện tử được sử dụng thay cho ánh sáng (trong kính hiển vi quang học). Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm điện tử:
Sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử: Điện tử được phát ra từ một catốt được đốt nóng (năng lượng nhiệt do đốt nóng sẽ cung cấp cho điện tử động năng để thoát ra khỏi liên kết với kim loại. Do bị đốt nóng nên súng phát xạ nhiệt thường có tuổi thọ không cao và độ đơn sắc của chùm điện tử thường kém. Nhưng ưu điểm của nó là rất rẻ tiền và không đòi hỏi chân không siêu cao. Các chất phổ biến dùng làm catốt là W, Pt, LaB6...
Sử dụng súng phát xạ trường (Field Emission Gun, các TEM sử dụng nguyên lý này thường được viết là FEG TEM): Điện tử phát ra từ catốt nhờ một điện thế lớn đặt vào vì thế nguồn phát điện tử có tuổi thọ rất cao, cường độ chùm điện tử lớn và độ đơn sắc rất cao, nhưng có nhược điểm là rất đắt tiền và đòi hỏi môi trường chân không siêu cao.
Sau khi thoát ra khỏi catốt, điện tử di truyển đến anốt rỗng và được tăng tốc dưới thế tăng tốc V (một thông số quan trọng của TEM). Lúc đó, điện tử sẽ thu được một động năng:
Và xung lượng p sẽ được cho bởi công thức:
Nguyên lý hoạt động của một thấu kính từ trong TEM
Như vậy, bước sóng của điện tử quan hệ với thế tăng tốc V theo công thức:
Với thế tăng tốc V = 100 kV, ta có bước sóng điện tử là 0,00386 nm. Nhưng với thế tăng tốc cỡ 200 kV trở nên, vận tốc của điện tử trở nên đáng kể so với vận tốc ánh sáng, và khối lượng của điện tử thay đổi đáng kể, do đó phải tính theo công thức tổng quát (có hiệu ứng tương đối tính):
Các hệ thấu kính và lăng kính
Vì trong TEM sử dụng chùm tia điện tử thay cho ánh sáng khả kiến nên việc điều khiển sự tạo ảnh không còn là thấu kính thủy tinh nữa mà thay vào đó là các thấu kính từ. Thấu kính từ thực chất là một nam châm điện có cấu trúc là một cuộn dây cuốn trên lõi làm bằng vật liệu từ mềm. Từ trường sinh ra ở khe từ sẽ được tính toán để có sự phân bố sao cho chùm tia điện tử truyền qua sẽ có độ lệch thích hợp với từng loại thấu kính. Tiêu cự của thấu kính được điều chỉnh thông qua từ trường ở khe từ, có nghĩa là điều khiển cường độ dòng điện chạy qua cuộn dây. Vì có dòng điện chạy qua, cuộn dây sẽ bị nóng lên do đó cần được làm lạnh bằng nước hoặc nitơ lỏng. Trong TEM, có nhiều thấu kính có vai trò khác nhau:
Hệ kính hội tụ và tạo chùm tia song song
Đây là hệ thấu kính có tác dụng tập trung chùm điện tử vừa phát ra khỏi súng phóng và điều khiển kích thước cũng như độ hội tụ của chùm tia. Hệ hội tụ C1 có vai trò điều khiển chùm tia vừa phát ra khỏi hệ phát điện tử được tập trung vào quỹ đạo của trục quang học. Khi truyền đến hệ C2, chùm tia sẽ được điều khiển sao cho tạo thành chùm song song (cho các CTEM) hoặc thành chùm hội tụ hẹp (cho các STEM, hoặc nhiễu xạ điện tử chùm tia hội tụ) nhờ việc điều khiển dòng qua thấu kính hoặc điều khiển độ lớn của khẩu độ hội tụ C2.
Các loại vật kính
Nguyên lý ghi ảnh trường sáng và trường tối trong TEM:là thấu kính ghi nhận chùm điện tử đầu tiên từ mẫu vật và luôn được điều khiển sao cho vật sẽ ở vị trí có khả năng lấy nét khi độ phóng đại của hệ được thay đổi.
Thấu kính nhiễu xạ và thấu kính Lorentz
Có vai trò hội tụ chùm tia nhiễu xạ từ các góc khác nhau và tạo ra ảnh nhiễu xạ điện tử trên mặt phẳng tiêu của thấu kính;
Được sử dụng trong KHV Lorentz để ghi ảnh cấu trúc từ của vật rắn. Thấu kính Lorentz khác vật kính ở chỗ không điều chỉnh vật ở vị trí lấy nét và có tiêu cự lớn (nhằm khuếch đại góc lệch do tương tác điện từ vốn rất nhỏ);
Ngoài ra, trong TEM còn có các hệ lăng kính có tác dụng bẻ đường đi của điện tử để lật ảnh hoặc điều khiển việc ghi nhận điện tử trong các phép phân tích khác nhau.
Các khẩu độ
Là hệ thống các màn chắn có lỗ với độ rộng có thể thay đổi nhằm thay đổi các tính chất của chùm điện tử như khả năng hội tụ, độ rộng, lựa chọn các vùng nhiễu xạ của điện tử...
Khẩu độ hội tụ (Condenser Aperture): là hệ khẩu độ được dùng cùng với hệ thấu kính hội tụ, có tác dụng điều khiển sự hội tụ của chùm tia điện tử, thay đổi kích thước chùm tia và góc hội tụ của chùm tia, thường mang ký hiệu C1 và C2. Nguyên lý của điều chỉnh điều kiện tương điểm.
Khẩu độ vật (Objective Aperture) : được đặt phía bên dưới vật có tác dụng hứng chùm tia điện tử vừa xuyên qua mẫu vật nhằm: thay đổi độ tương phản của ảnh, hoặc lựa chọn chùm tia ở các góc lệch khác nhau (khi điện tử bị tán xạ khi truyền qua vật).
Khẩu độ lựa chọn vùng (Selected Area Aperture): được dùng để lựa chọn diện tích vùng mẫu vật sẽ ghi ảnh nhiễu xạ điện tử, được dùng khi sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng.
Sự tạo ảnh trong kính hiển vi TEM
Xét trên nguyên lý, ảnh của TEM vẫn được tạo theo các cơ chế quang học, nhưng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tương phản khác so với ảnh trong KHV quang học và các loại KHV khác. Nếu như ảnh trong KHV có độ tương phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng thì độ tương phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử. Các chế độ tương phản trong TEM:
Ảnh trường sáng (a) và trường tối mẫu hợp kim FeSiBNbCu.
Tương phản biên độ: đem lại do hiệu ứng hấp thụ điện tử (do độ dày, do thành phần hóa học) của mẫu vật.
Tương phản pha: có nguồn gốc từ việc các điện tử bị tán xạ dưới các góc khác nhau.
Tương phản nhiễu xạ: liên quan đến việc các điện tử bị tán xạ theo các hướng khác nhau do tính chất của vật rắn tinh thể.
Bộ phận ghi nhận và quan sát ảnh
Khác với kính hiển vi quang học, TEM sử dụng chùm điện tử thay cho nguồn sáng khả kiến nên cách quan sát ghi nhận cũng khác. Để quan sát ảnh, các dụng cụ ghi nhận phải là các thiết bị chuyển đổi tín hiệu, hoạt động dựa trên nguyên lý ghi nhận sự tương tác của điện tử với chất rắn.
Màn huỳnh quang và phim quang học: là dụng cụ ghi nhận điện tử dựa trên nguyên lý phát quang của chất phủ trên bề mặt. Trên bề mặt của màn hình, người ta phủ một lớp vật liệu huỳnh quang. Khi điện tử va đập vào màn hình, vật liệu sẽ phát quang và ảnh được ghi nhận thông qua ánh sáng phát quang này. Cũng tương tự nguyên lý này, người ta có thể sử dụng phim ảnh để ghi lại ảnh và ảnh ban đầu được lưu dưới dạng phim âm bản và sẽ được tráng rửa sau khi sử dụng.
CCD Camera (Charge-couple Device Camera)
Điều kiện tương điểm
Ảnh hiển vi điện tử độ phân giải cao chụp lớp phân cách Si/SiO2, có thể thấy các lớp nguyên tử Si
Điều kiện tương điểm có nguyên lý giống như điều kiện tương điểm trong quang học, tức là điều kiện để ảnh của một vật phẳng nằm trên một mặt phẳng. Trong TEM, điều kiện tương điểm liên quan đến việc điều chỉnh cân bằng các chùm tia và các hệ thấu kính.
Điều kiện tương điểm hệ hội tụ (Condenser Astigmatism)
Là việc điều chỉnh hệ thấu kính hội tụ sao cho chùm tia có tính chất đối xứng trục quang học. Khi quang sát trên màn ảnh, chùm tia phải có hình tròn và hội tụ đồng tâm tại một điểu (khi mở rộng và thu hẹp). Nguyên lý của việc điều chỉnh này là điều chỉnh sự cân bằng của từ trường sinh ra trong các cuộn dây của thấu kính hội tụ.
Điều kiện tương điểm vật (Objective Astigmatism)
Là việc điều chỉnh vật kính sao cho mặt phẳng của mẫu vật song song với mặt phẳng quang học của vật kính, sao cho các chùm tia xuất phát từ các điểm trên cùng một mặt phẳng sẽ hội tụ tại một mặt phẳng song song với vật.
Điều kiện tương điểm nhiễu xạ (Diffraction Astigmatism)
Tương điểm nhiễu xạ là điều chỉnh cho trục quang học của chùm tia trùng với trục quang học của quang hệ. Khi đó, vân nhiễu xạ trung tâm trên mặt phẳng tiêu của vật kính sẽ phải đối xứng đồng tâm qua trục quang học và sẽ nằm đúng trên mặt phẳng của khẩu độ vật kính.
Ảnh hưởng của tính tương điểm lên chất lượng ảnh ở điều kiện độ phóng đại thấp là rất nhỏ, nhưng khi tăng độ phóng đại đến cỡ lớn (trên 50 ngàn lần) thì ảnh hưởng của tính tương điểm trở nên rõ rệt. Khi đó, nếu quang hệ không thỏa mãn tính chất tương điểm sẽ có thể dẫn đến việc ảnh có thể bị bóp méo, không thể lấy nét hoặc độ phân giải rất kém. Đặc biệt, ở chế độ ghi ảnh có độ phân giải cao, yêu cầu về độ tương điểm càng lớn.
Ảnh trường sáng, trường tối
Là chế độ ghi ảnh phổ thông của các TEM dựa trên nguyên lý ghi nhận các chùm tia bị lệch đi với các góc (nhỏ) khác nhau sau khi truyền qua mẫu vật.
Ảnh trường sáng (Bright-field imaging): Là chế độ ghi ảnh mà khẩu độ vật kính sẽ được đưa vào để hứng chùm tia truyền theo hướng thẳng góc. Như vậy, các vùng mẫu cho phép chùm tia truyền thẳng góc sẽ sáng và các vùng gây ra sự lệch tia sẽ bị sáng. Ảnh trường sáng về mặt cơ bản có độ sáng lớn.
Ảnh trường tối (Dark-field imaging): Là chế độ ghi ảnh mà chùm tia sẽ bị chiếu lệch góc sao cho khẩu độ vật kính sẽ hứng chùm tia bị lệch một góc nhỏ (việc này được thực hiện nhờ việc tạo phổ nhiễu xạ trước đó, mỗi vạch nhiễu xạ sẽ tương ứng với một góc lệch). Ảnh thu được sẽ là các các đốm sáng trắng trên nền tối. Nền sáng tương ứng với các vùng mẫu có góc lệch được chọn, nền tối là từ các vùng khác. Ảnh trường tối rất nhạy với cấu trúc tinh thể và cho độ sắc nét từ các hạt tinh thể cao.
Ảnh hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao
Xử lý mẫu màng mỏng chụp cắt ngang bằng chùm ion hội tụ: Là một trong những tính năng mạnh của kính hiển vi điện tử truyền qua, cho phép quan độ phân giải từ các lớp tinh thể của chất rắn. Trong thuật ngữ khoa học, ảnh hiển vi điện tử độ phân giải cao thường được viết tắt là HRTEM (là chữ viết tắt High-Resolution Transmission Electron Microscopy). Chế độ HRTEM chỉ có thể thực hiện được khi:
- Kính hiển vi có khả năng thực hiện việc ghi ảnh ở độ phóng đại lớn.
- Quang sai của hệ đỏ nhỏ cho phép (liên quan đến độ đơn sắc của chùm tia điện tử và sự hoàn hảo của các hệ thấu kính.
- Việc điều chỉnh tương điểm phải đạt mức tối ưu.
- Độ dày của mẫu phải đủ mỏng (thường dưới 70 nm).
HRTEM là một công cụ mạnh để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của các vật liệu rắn.
Ảnh cấu trúc từ
Đối với các mẫu có từ tính, khi điện tử truyền qua sẽ bị lệch đi do tác dụng của lực Lorentz và việc ghi lại ảnh theo cơ chế này sẽ cung cấp các thông tin liên quan đến cấu trúc từ và cho phép nghiên cứu các tính chất từ vi mô của vật liệu. Chế độ ghi ảnh này đã phát triển thành hai kiểu:
- Kính hiển vi Lorentz.
- Toàn ảnh điện tử
Ưu điểm của TEM là cho phép ghi ảnh với độ phân giải cao và có độ nhạy cao với sự thay đổi cấu trúc nên các chế độ ghi ảnh từ tính cũng là các công cụ mạnh trong các nghiên cứu về vi từ.
Xử lý mẫu và các phép phân tích trong TEM
Nhiễu xạ điện tử
Nhiễu xạ điện tử là một phép phân tích mạnh của TEM. Khi điện tử truyền qua mẫu vật, các lớp tinh thể trong vật rắn đóng vai trò như các cách tử nhiễu xạ và tạo ra hiện tượng nhiễu xạ trên tinh thể. Đây là một phép phân tích cấu trúc tinh thể rất mạnh.
Các phép phân tích tia X
Nguyên lý của các phép phân tích tia X là dựa trên hiện tượng chùm điện tử có năng lượng cao tương tác với các lớp điện tử bên trong của vật rắn dẫn đến việc phát ra các tia X đặc trưng liên quan đến thành phần hóa học của chất rắn. Do đó, các phép phân tích này rất hữu ích để xác định thành phần hóa học của chất rắn. Có một số phép phân tích như:
Phổ tán sắc năng lượng tia X (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS, hay EDX)
Phổ huỳnh quang tia X (X-ray Luminescent Spectroscopy)
Phân tích năng lượng điện tử
Các phép phân tích này liên quan đến việc chùm điện tử sau khi tương tác với mẫu truyền qua sẽ bị tổn hao năng lượng (phổ tổn hao năng lượng điện tử - Electron Energy Loss Spectroscopy, EELS), hoặc phát ra các điện tử thứ cấp (phổ Ausger) hoặc bị tán xạ ngược. Các phổ này cho phép nghiên cứu phân bố các nguyên tố hóa học, các liên kết hóa học hoặc các cấu trúc điện từ...
Xử lý mẫu cho phép đo TEM
Vì sử dụng chế độ điện tử đâm xuyên qua mẫu vật nên mẫu vật quan sát trong TEM luôn phải đủ mỏng. Xét trên nguyên tắc, TEM bắt đầu ghi nhận được ảnh với các mẫu có chiều dày dưới 500 nm, tuy nhiên, ảnh chỉ trở nên có chất lượng tốt khi mẫu mỏng dưới 150 nm. Vì thế, việc xử lý (tạo mẫu mỏng) cho phép đo TEM là cực kỳ quan trọng.
Phương pháp truyền thống: phương pháp truyền thống là sử dụng hệ thống mài cắt cơ học. Mẫu vật liệu được cắt ra thành các đĩa tròn (có kích thước đủ với giá mẫu) và ban đầu được mài mỏng đến độ dày dưới 10 μmm (cho phép ánh sáng khả kiến truyền qua). Tiếp đó, việc mài đến độ dày thích hợp được thực hiện nhờ thiết bị mài bằng chùm iôn, sử dụng các iôn khí hiếm (được gia tốc với năng lượng dưới 10 kV) bắn phá đến độ dày thích hợp. Cách thức xử lý này tốn nhiều thời gian và đòi hỏi mức độ tỉ mỉ rất cao.
Sử dụng kỹ thuật chùm iôn hội tụ: kỹ thuật chùm iôn hội tụ là thực hiện việc xử lý mẫu trên thiết bị cùng tên. Người ta dùng một chùm ion (của kim loại lỏng, thường là Ga), được gia tốc tới năng lượng cao (cỡ 30 - 50 kV) được hội tụ thành một chùm rất nhỏ và được điều khiển nhờ hệ thấu kính điện từ để cắt ra các lát mỏng, hàn gắn trên giá mẫu và mài mỏng đến mức độ đủ mỏng. Các công việc được tiến hành nhờ điều khiển bằng máy tính và trong chân không cao. Phép xử lý này tiến hành rất nhanh và có thể cho mẫu rất mỏng, nhưng đôi khi mẫu bị nhiễm bẩn từ các ion Ga.
Từ kính hiển vi cổ điển đến hiện đại
Kính hiển vi điện tử truyền qua truyền thống (Conventional TEM - CTEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua truyền thống (thường được viết tắt là CTEM, từ tên gọi Conventional Transmission Electron Microscope) là kính hiển vi điện tử truyền qua thông thường, sử dụng chùm điện tử song song chiếu xuyên qua mẫu vật. Vì chùm điện tử là song song nên góc tán xạ của điện tử khi truyền qua mẫu là nhỏ do đó các phép phân tích bị hạn chế.
Kính hiển vi điện tử truyền qua quét là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng khác với CTEM là chùm điện tử truyền qua mẫu là một chùm điện tử được hội tụ thành một chùm hẹp và được quét trên mẫu. Nhờ việc điều khiển khẩu độ và thấu kính hội tụ, chùm điện tử có thế hội tụ thành một chùm tia có kích thước rất hẹp (các STEM mạnh hiện nay có thể cho kích thước tới dưới 1 nm) do đó cho phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao. Hơn nữa, vì chùm điện tử là hội tụ, nên góc tán xạ của điện tử sau khi truyền qua mẫu sẽ rất lớn và tạo ra nhiều phép phân tích mạnh, ví dụ như phép ghi ảnh trường tối với góc lệch vành khuyên lớn (High-annular dark-field imaging - HADF), khả năng phân tích phân bố các nguyên tố với độ phân giải cực cao nhờ phép phân tích phổ tổn hao năng lượng điện tử (EELS) thực hiện đồng thời với quá trình ghi ảnh. Hơn nữa, ảnh độ phân giải cao trực tiếp liên quan đến nguyên tử khối của các nguyên tố, do đó rất hữu ích cho việc phân tích sự phân bố của các nguyên tố hóa học.
STEM lần đầu được xây dựng năm 1938 bởi Manfred von Ardenne của công ty Siemens (Berlin, Đức) chỉ sau một thời gian TEM xuất hiện, nhưng hầu như không thể phát triển do việc khó khăn trong việc hội tụ chùm điện tử có tính đơn sắc kém vào điểm nhỏ. Tuy nhiên, phải đến năm 1970 STEM mới thực sự phát triển nhờ việc tạo ra chùm điện tử có độ đơn sắc cao nhờ súng phát xạ trường (FEG). Cho đến hiện nay, STEM là công cụ mạnh để ghi ảnh với độ phân giải tới cấp nguyên tử. Trong những nghiên cứu phát triển STEM hiện nay, mục tiêu loại trừ quang sai (do tính không hoàn toàn đơn sắc của chùm điện tử) đang là vấn đề cấp bách để đạt được các STEM có độ phân giải cực lớn. Nhiều dự án xây dựng các STEM mạnh đang được phát triển dựa trên mục tiêu này và người ta đang xây dựng những STEM có khả năng phân giải cao, gọi là SuperSTEM.
Toàn ảnh điện tử
Là một thiết bị nghiên cứu cấu trúc điện từ của vật rắn dựa trên cấu trúc của KHV điện tử truyền qua. Toàn ảnh điện tử dựa trên việc ghi lại ảnh toàn ký của chùm điện tử truyền qua vật được giao thoa với chùm điện tử mẫu, đưa đến các thông tin về cấu trúc từ với độ phân giải không gian rất cao.
Ưu điểm và hạn chế của KHV TEM
Dù được phát triển từ rất lâu, nhưng đến thời điểm hiện tại, TEM vẫn là một công cụ nghiên cứu mạnh và hiện đại trong nghiên cứu về cấu trúc vật rắn, được sử dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, khoa học vật liệu, công nghệ nanô, hóa học, sinh học, y học... và vẫn đang trong quá trình phát triển với nhiều tính năng và độ mạnh mới.
Điểm mạnh của TEM
+ Có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tương phản, độ phân giải (kể cả không gian và thời gian) rất cao đồng thời dễ dàng thông dịch các thông tin về cấu trúc. Khác với dòng KHV quét đầu dò, TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử.
+ Đi kèm với các hình ảnh chất lượng cao là nhiều phép phân tích rất hữu ích đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu.
Điểm yếu của TEM
+ Đắt tiền: TEM có nhiều tính năng mạnh và là thiết bị rất hiện đại do đó giá thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao ví dụ chân không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm.
+ Đòi hỏi nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá hủy mẫu (điều này không thích hợp với nhiều tiêu bản sinh học).
+ Việc điều khiển TEM rất phức tạp và đòi hỏi nhiều bước thực hiện chính xác cao.
Ứng dụng trong nghiên cứu của các loại kính hiển vi
Kính hiển vi quang học (Optical microscopy)
Trước khi nói về kính hiển vi quang học, chúng ta đều biết đến kính hiển vi quang học (thực tập VLĐC năm I đều được sử dụng, xem hình dưới). KHV vi quang học (Optical Microscopy - OM) sử dụng ánh sáng chiếu qua vật, tạo hình ảnh của vật (lớn hơn vật thật) thông qua các thấu kính quang học (optical lens).Chúng ta biết rằng ánh sáng không thể nhiễu xạ trên các vật có kích thước quá nhỏ, nên do đó, độ phân dải của OM bị giới hạn bởi nửa bước sóng ánh sáng khả kiến. Một số ứng dụng của KHV quang học trong lĩnh vực nghiên cứu sốt rét, ký sinh trùng, côn trùng:
Trong nghiên cứu đơn bào sốt rét:
+ Xét nghiệm lam máu và soi kính hiển vi phát hiện, chẩn đoán loài đơn bào sốt rét đến nay vẫn được xem là “chẩn vàng” chẩn đoán. Mặc dù, hiện nay có rất nhiều phương pháp, kỹ thuạt hiện đại giúp chẩn đoán sớm bệnh như test chẩn đoán nhanh, quang phổ, quang phổ khối đơn dòng, đa dòng; sinh học phân tử PCR, …, nhưng chưa có phương pháp hay kỹ thuật nào thay thế hoặc bao phủ tính năng toàn vẹn của chúng vì đây là một phương pháp vừa mang tính định tính vừa mang tính định lượng, không những giúp chẩn đoán, theo dõi điều trị mà còn tiên lượng được bệnh;
+ Bên cạnh đó, chúng còn là công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu mảng đánh giá thường quy hiệu lực thuốc theo các phác đồ của Bộ Y tế hiện hành mà còn đánh giá hiệu lực của các thuốc sốt rét mới hay nghiên cứu kháng thuốc;
+ Các phương pháp khác dù có hiện đại, nhanh, chính xác,…cũng không thể thay thế hoàn toàn tính ưu việt của KHV mà chỉ mang tính chất hỗ trợ.
Trong nghiên cứu ký sinh trùng giun sán:
+ Xét nghiệm mẫu phân thu thập tại cộng đồng hoặc trên bệnh nhân đang nằm điều trị, xử lý rồi soi dưới KHV cho phép chúng ta xác định một số loại trứng, ấu trùng, hoặc con trưởngthành của một số loài giun, sán ký sinh gây bệnh trên người hoặc trên động vật và lây sang người (người chỉ là vật chủ tình cờ);
+ KHV là công cụ giúp theo dõi diễn tiến điều trị các ca bệnh trên lâm sàng bệnh viện;
+ Cũng như trong phát hiện, chẩn đoán đơn bào sốt rét, kỹ thuật sử dụng KHV cũng giúp cho đánh giá hiệu lực thuốc điều trị giun sán, tình trạng và mức độ kháng thuốc giun sán ở người và gia súc, thông qua đánh giá các tỷ lệ sạch trứng, chỉ số giảm trứng,…
Trong nghiên cứu côn trùng truyền bệnh:
+ Sau khi thu thập hoặc làm tiêu bản muỗi, có thể sử dụng KHV để soi định loại muỗi, đánh giá tỷ lệ có mặt các loài muỗi tại vùng nghiên cứu;
+ Hoặc mổ muỗi nghiên cứu sự có mặt hay có thoi trùng và các vấn đề liên quan khác.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmision Electron Microscope - TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua hoạt động trên nguyên tắc giống thấu kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử (thay cho bước sóng ánh sáng) nên có bước sóng rất ngắn (Chúng ta biết rằng bước sóng của sóng điện tử tỉ lệ nghịch với động năng của điện tử) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens (thay cho thấu kính quang học).
Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học
Điện tử đước phát ra từ nguồn phát điện tử. Nguồn phát có thể là ống phóng tia cathode (Cathode ray tube - CRT), hoặc dùng ống phát xạ trường (không dùng sợi đốt như ống CRT). Ưu điểm của ống phát xạ trường là không dùng sợi đốt nên có tuổi thọ rất cao, ít phải thay thế, nhưng giá thành cao gấp nhiều lần so với ống CRT.
Một số ứng dụng kính hiển vi điện tử quét trong nghiên cứu giun sán:
+ Lợi dụng các tính năng của kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi truyền qua, các nhà khoa học đã kiểm tra được về mặt vi thể, lẫn đại thể của giun, sán;
+ Ứng dụng kính TEM và SEM với mục đích sau: [1] Cấu trúc hoặc siêu cấu trúc của giun sán (Fasciola spp, Thelazia spp.); [2] Định loài bằng chình thái học và chẩn đoán, xác định loài dựa trên cấu trúc giải phẩu của giun sán như cấu trúc nhú, vị trí lỗ hậu môn, vòng gai, điểm nối thực quản-ruột, lớp vỏ cutile,…[3] Sự thay đổi cấu trúc đại thể và vi thể trong trường hợp nhạy (sensitivity strain) hoặc kháng (resistance strain) thuốc điều trị; chẳng hạn, trong trường hợp sán lá gan lớn Fasciola spp. kháng trị với triclabendazole thì trên cấu trúc tegument không có hoặc có thay đổi rất ít giải phẩu bề mặt, nếu thuốc còn nhạy thì tegument bị tác động bởi thuốc cho hình ảnh nốt sưng phồng, rộp và vở, thoát dịch, rách, cuối cùng hoại tử luôn toàn bộ cấu trúc và sán chết.
Việt Nam với thành công của chiếc kính hiển vi nhìn thấy ở mức độ nano
Viện Vật lý ứng dụng và Thiết bị khoa học vừa công bố kính hiển vi quét đầu dò (SPM) - thiết bị thuộc loại cao cấp nhất được chế tạo tại nước ta. Bước đột phá này đã mở rộng đường cho ngành công nghệ nano - sinh học phân tử của Việt Nam. Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam tiến hành chế tạo SPM cực kỳ tinh vi, nó chụp được hình một con virus vào cỡ 100 nanomét (1 nanomét = 1 phần tỷ mét) mà không cần dùng tới chân không... Đây là sự việc đáng ghi nhớ trong nền khoa học công nghệ Việt Nam".
GS Trần Xuân Hoài, Viện trưởng và là chủ nhiệm đề tài, cho biết: SPM là tên chung của một họ kính hiển vi hoạt động theo nguyên lý mới, được các nhà vật lý thế giới phát minh gần đây, dùng để nghiên cứu đặc điểm bề mặt ở cấp độ cực nhỏ (nguyên tử). Kính hoạt động theo nguyên lý quét một mũi dò nguyên tử trên một bề mặt mẫu ở khoảng cách nguyên tử. Hình ảnh sẽ được hiển thị trên máy tính với hệ số phóng đại lớn ở dạng một chiều, hai chiều hoặc ba chiều.
Kính SPM đã được các hãng lớn trên thế giới cung cấp, thương mại hóa từ khá lâu, nhưng với giá thành rất đắt, có khi đến hàng triệu đôla một chiếc. Mặt khác chúng cũng nhanh chóng lạc hậu nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng được trang bị, nhất là với nước đang phát triển như Việt Nam. Hiện nước ta chỉ có một thiết bị SPM duy nhất mua của Mỹ, do vậy các nhà khoa học cũng như học sinh, sinh viên rất khó tiếp cận với nó để phục vụ công tác nghiên cứu.
SPM khắc phục được nhược điểm của hai loại kính quen thuộc trong phòng thí nghiệm hiện nay là kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử. Kính quang học không thể phóng đại các mẫu vật nhỏ hơn 1 phần triệu mét, như virus và phân tử, còn kính hiển vi điện tử lại kềnh càng và rất đắt tiền. Ngoài ra, với hai loại kính này, mẫu vật phải được đặt trong buồng hút chân không, tức là qua các công đoạn làm chết, sấy khô rồi bị phủ, mạ... Vì thế, nhà nghiên cứu chỉ nhìn được mẫu vật ở dạng không nguyên vẹn. Trong khi đó, SPM có thể quan sát trực tiếp mọi chất liệu (như kim loại, bán dẫn, sứ, hữu cơ, đại phân tử...) trong môi trường không khí, mà không đòi hỏi phải xử lý trước.
Chiếc kính hiển vi SPM của Việt Nam đã được thử nghiệm để đo cấu trúc màng TiO2 và xác định hình dạng, cấu trúc của virus gây bệnh xoăn lá cà chua cho ra hình ảnh rất rõ nét. Những hình ảnh này sẽ hỗ trợ đắc lực các nhà nghiên cứu trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm, tìm hiểu đặc tính gây bệnh của các loài sâu bệnh...
Công trình thuộc khuôn khổ các đề tài trọng điểm cấp nhà nước, do Bộ KH&CN đặt hàng với Viện từ cuối năm 2001. Để thực hiện việc chế tạo này, nhóm nghiên cứu đã phát triển một loạt công nghệ cao trong đó nhiều công nghệ lần đầu có mặt tại Việt Nam như phát hiện và đo lường tín hiệu cực nhỏ (đo dòng điện cỡ pA, lực cỡ nN, kích cỡ nm), kỹ thuật cách ly dao động... (Ảnh chụp màng mỏng chế tạo tại Viện Ứng dụng công nghệ, cho thấy các mẫu hạt nano TiO2 trên đế mica).
Theo đánh giá của Hội đồng nghiệm thu, việc chế tạo thành công kính hiển vi SPM sẽ cho phép các phòng thí nghiệm ở nước ta hoàn toàn chủ động trong việc vận hành những công cụ phân tích hình ảnh ở mức nano, cũng như sinh học phân tử, làm cơ sở cho sự phát triển các ngành khoa học then chốt của Việt Nam. Hội đồng cũng đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ cho phép Viện thành lập doanh nghiệp trong lĩnh vực này để hoàn thiện và sản xuất thiết bị SPM phục vụ nhu cầu của các đơn vị nghiên cứu, tiến tới xuất khẩu thiết bị công nghệ cao.
Kính hiển vi đảo ngược
Kính hiển vi đảo ngược là công cụ không thể thiếu trong nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu vật liệu sống, công nghệ sinh học, di truyền học tế bào và những phương pháp kỹ thuật cổ điển trong nuôi cấy tế bào. Lọai kính này đang được nâng cấp thành những hệ thống chuyên dụng cho những ứng dụng thông thường và những phát triển nghiên cứu đặc biệt. Dòng sản phẩm kính hiển vi Wilovert của Hund được thiết kế riêng biệt cho xu hướng này.
Với những phương pháp khác nhau về sự tương phản và bộ nối hùynh quang, những thiết bị này phù hợp cho nhiều ứng dụng nghiên cứu trong lãnh vực:
+ Chăn nuôi, sinh vật học tế bào;
+ Nghiên cứu bệnh học tế bào;
+ Nghiên cứu miễn dịch;
+ Nghiên cứu về hồ, nghiên cứu nấm;
+ Nghiên cứu vật ký sinh, trong đó có ký sinh trùng;
+ Nghiên cứu dược lý và các nghiên cứu liên quan trong phòng thí nghiệm
Đặc điểm kính hiển vi đảo ngược
Thân kính Wilovert dạng đúc khối hình chữ U giúp kính độ ổn định cao. Bộ đảo mini có thể dễ dàng lắp vào với các kính hiển vi trong lọat Wilovert;
Dãi lựa chọn rộng cho các nguồn sáng: Đèn Halogen 6V / 20W và 6V / 30W, ngoài ra có thể chọn đèn 12V / 50W hoặc 12V / 100W. Đèn thủy ngân HBO 50W hoặc HBO 100W cho nguồn sáng hùynh quang;
Vật kính: Đối với kính hiển vi đảo mẫu được nghiên cứu trong những lọ nuôi cấy mô với những chiều cao, độ dầy và vật liệu khác nhau, trái lại với những lam kính và lamen mẫu chuẩn được dùng cho kính hiển vi đứng, đòi hỏi phải có phần quang học đặc biệt;
Tụ quang, có nhiều lựa chọn:
+ Tụ quang NA 0.25 cho nền sáng ánh sáng truyền qua với khỏang cách làm việc 58 mm;
+ Tụ quang kết hợp NA 0.25 với khỏang cách làm việc 58 mm cho nền sáng ánh sáng truyền qua và phản pha
+ Tụ quang NA 0.4 cho nền sáng ánh sáng truyền qua với khỏang cách làm việc 55 mm
+ Tụ quang kết hợp NA 0.4 với khỏang cách làm việc 38 mm cho nền sáng ánh sáng truyền qua và phản pha
Giá đỡ cho những lọ nuôi cấy: những lọ nuôi cấy thường được sử dụng như đĩa Petri, lọ nuôi cấy mô, khay microtest và khay microtiter được đặt trong những khung giữ đặc biệt trên kính hiển vi Wilovert. Bộ phận dẫn hướng mục tiêu đảm bảo mẫu được quét hoàn toàn.
WILOVERT AS HF
Đây là bộ chuẩn cho ứng dụng nghiên cứu những mẫu trong suốt trong nền sáng. Điểm thuận lợi của bộ này là đơn giản, cấu hình sắp xếp rõ ràng, cho phép người sử dụng có nhiều phạm vi sử dụng.
Cấu hình WILOVERT AS HF :
- Vật kính nền sáng
A 4/0.10
A 10/0.25
- Thị kính ( 02 cái) WF 10x/18
WILOVERT AS PH
Kính hiển vi thông thường cho kiểm sóat nuôi cấy tế bào trong nền sáng và phản pha
Cấu hình WILOVERT AS PH :
- Vật kính nền sáng : A 4/0.10
- Vật kính phản pha/nền sáng : APh 10/0.25
- Vật kính phản pha/nền sáng : SPL Ph 20/0.35
- Thị kính (02 cái): WF 10x/18
- Tụ quang kết hợp NA 0.25 (nền sáng + phản pha)
Tài liệu tham khảo
1. Williams D.B., Carter C.B (1996). Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science, Kluwer Academic / Plenum Publishers. ISBN 0-306-45324-X.
2. De Graef M. (2003). Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy, Cambridge University Press. ISBN 0-521-62995.
3. Browning, N. D.; Chisholm M. F. & Pennycook S. J. Atomic-resolution chemical analysis using a scanning transmission electron microscope, Nature 336 (1993) 143-146.
4. SuperSTEM Project, United Kingdom