Hình 1. Phân tử DNA |Nguồn: https://pressbooks.umn.edu/cvdl/module-4-1-PCR
Xét nghiệm SHPT là một phản ứng tổng hợp chuỗi gen PCR, là một bước tiến nhảy vọt từ thành công của kỹ thuật nhận dạng và giải trình gen. Kỹ thuật này nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh được nhanh chóng và chính xác hơn để phục vụ cho quá trình điều trị được hiệu quả hơn.Trong xét nghiệm SHPT, bắt buộc phải sử dụng chứng dương và chứng âm.
Chứng dương là các mẫu chứng có chứa đoạn ADN/ARN mục tiêu đã được biết trước. Chứng âm là những mẫu chứng không có đoạn ADN/ARN mục tiêu để nhằm giúp kiểm soát được quá trình nhiễm chéo khi thực hiện các phản ứng.Xét nghiệm SHPT dùng 2 kỹ thuật chính là tổng hợp PCR và real-time PCR.
Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR-Polymerase Chain Reaction) nói riêng và các kỹ thuật dựa trên nền tảng PCR (PCR-based techniques) nói chung đã và đang được sử dụng phổ biến bởi tính nhạy, đặc hiệu, độ chính xác cao trong kết quả trong xét nghiệm lĩnh vực y học hiện đại để phát hiện, chẩn đoán và phân tích di truyền một số bệnh đặc hiệu có liên quan đến những tác nhân virus, vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm mà lâu nay chúng ta đang đối mặt thách thức “khó hoặc không thể tìm thấy bằng các kỹ thuật xét nghiệm truyền thống”.
Xét nghiệm PCR này có ý nghĩa đặc biệt phát hiện, chẩn đoán một số tác nhân khó hoặc không thể nuôi cấy trong môi trường xét nghiệm thường quy như vi khuẩn (Mycoplasmaspp., Chlamydiaspp.,...), virus (HIV, Dengue, H5N1, viêm gan B, viêm gan C), ký sinh trùng (sốt rét, giun sán và đơn bào); PCR có thể giúp tìm và phát hiện những tác nhân đã nuôi cấy nhưng thất bại bởi trước đó do bị chết hoặc có mật độ rất thấp trong các mẫu bệnh phẩm như viêm màng não mủ bị “cụt đầu/mất đầu”, vi khuẩn lao bị thất bại trong nuôi cấy; tìm và phát hiện chủng vi khuẩn kháng thuốc, phát hiện các chủng virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết, xác định đột biến gen liên quan đến ung thư, đột biến gen kháng thuốc.Ngoài lĩnh vực y học, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh trong đa dạng lĩnh vực khác bao gồm: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm, định danh,..
1. Sơ lược về kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là kỹ thuật cho phép khuếch đại một đoạn gen trong ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt. Dựa vào thành phần phản ứng cần thiết, đoạn gen mục tiêu sẽ được nhân bản ra hàng triệu bản sao giống nhau, từ đó phục vụ mục đích nghiên cứu tiếp theo. Đây được xem là một quá trình cơ bản cho việc phát triển của hàng loạt công nghệ phân tích gen và hệ gen sau này.
Hình 2. Hệ thông PCR và một số máy chạy PCR, qPCR va ddPCR
Nguồn: https://microbenotes.com/pcr-principle-enzymes-steps-types-uses/
Kỹ thuật PCR được nhà hóa sinh học người Mỹ Kary Mullis phát triển dựa trên ý tưởng muốn xây dựng một quy trình giúp đoạn ADN có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ phản ứng thông qua xúc tác của enzyme ADN polymerase. Ý tưởng này khi ông muốn khuyếch đại tạo ra nhiều bản sao, một đoạn ADN mà không cần dùng các sinh vật sống như vi khuẩn E. coli hay nấm men để tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn, sau đó dùng các cặp mồi bổ sung để bắt cặp với mạch đơn, tái bản nhờ enzyme ADN polymerase.
Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ. PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp có thể tạo ra một lượng lớn bản sao của một đoạn ADN mong đợi. Điểm thú vị là enzyme ADN polymerase phân lập từ E. coli không bền với nhiệt, cần được bổ sung sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ nhiệt, nên quy trình này chậm, tốn kém và mất nhiều công sức.
Vấn đề này đã được giải quyết khi nhà vi sinh vật học Thomas Brock tình cờ phát hiện ra vi khuẩn chịu nhiệt Thermophilus aquaticus (hay Taq) ở khu vực suối nước nóng (>70oC) tại Yellowstone (Mỹ) vào đầu những năm 60. Việc phát hiện ra enzyme Taq polymerase đã giúp PCR trở thành một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử, là một trong những kỹ thuật cơ bản được ứng dụng ở tất cả phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay.
Hiện PCR được dùng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ y học, cổ sinh vật học đến pháp y. Một trong những ứng dụng phổ biến nhất của PCR là trong lĩnh vực khoa học pháp y. Trước khi ra đời kỹ thuật PCR, một mẫu DNA nhỏ có thể không đủ để thực hiện xét nghiệm chính xác và đưa ra kết luận chắc chắn. Tuy nhiên, bằng kỹ thuật PCR, các nhà nghiên cứu có thể tạo đủ lượng ADN để xác định hài cốt từ các vụ tai nạn hay thảm họa trong quá khứ.
Tương tự, mẫu DNA nhỏ được phục hồi từ hiện trường vụ án có thể nhờ PCR sau đó xác định hoặc giúp loại trừ các nghi phạm.Trong y học, PCR trở thành một công cụ quan trọng nghiên cứu ung thư. PCR được sử dụng để phát hiện một số bệnh ung thư do virus gây ra như ung thư cổ tử cung (HPV), ung thư da, ung thư miệng. Một ứng dụng y tế quan trọng khác của PCR là trong quy trình phân loại mô để xem xét khả năng tương hợp giữa mô người hiến tạng và bệnh nhân cần trải qua cấy ghép nội tạng, lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân, xét nghiệm quan hệ di truyền; xác định sớm các bệnh truyền nhiễm cũng như theo dõi sự lây lan của bệnh truyền nhiễm ở người. Ngoài ra, PCR có thể xác định cả nhiễm nấm và KST, khuếch đai DNA để sàng lọc máu được hiến để ngăn máu nhiễm bệnh xâm nhập vào ngân hàng máu.
Trong lĩnh vực cổ sinh vật học, PCR được dùng để khếch đại những mẫu DNA tồn tại trong mô hàng trăm năm. PCR có thể được dùng trên các mẫu mô xác ướp, hệ thực vật và động vật cổ đại, hoặc hóa thạch. Do đó, việc dùng PCR sẽ giúp xác định và tìm hiểu về các sinh vật hiện đã tuyệt chủng cùng các quá trình hóa thạch và tiến hóa.
Hình 3. Sơ đồ tổ chức khu vực xét nghiệm PCR thường quy
PCR được sử dụng để giúp phát hiện, xác định vi khuẩn và mầm bệnh có hại trong nguồn nước công cộng; phát hiện các vi sinh vật thoái hóa, nơi chất thải độc hại và sự cố ô nhiễm đã xảy ra.
2. Thành phần tối thiểu để phục vụ cho phản ứng PCR
Để thực hiện được một xét nghiệm PCR cần có các thành phần: DNA mẫu chứa đoạn DNA cụ thể đã được tinh sạch để dùng nhân bản về sau; mồi (đoạn ADN mồi) dài khoảng vài chục Kb để định vị điểm bắt đầu và điểm kết thúc đoạn DNA mẫu; DNA polymerase (enzyme đóng vai trò tổng hợp đoạn ADN bản sao của DNA mẫu), đây phải là loại enzyme có khả năng chịu nhiệt cao;
Nucleotides gồm 4 loại A, T, C và G có vai trò cấu tạo nên cấu trúc của DNA bản sao; Dung dịch đệm để cung cấp môi trường cho enzyme DNA polymerase hoạt động và các ống PCR chuyên dụng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị làm xét nghiệm PCR.
Hình 4. Các thành phần của PCR và Các chu kỳ của PCR chung
Cụ thể, polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase),enzym này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72oC; 4 loại nucleotide (dNTP) gồm dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng hợp ra các bản saoDNA; DNA chứa trình tự mục tiêu (Template), thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm; Cặp mồi đặc hiệu là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản; Cation Mg2+ (MgCl2) là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả và dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer) cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra.
Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quá trình nhân bản DNA được diễn ra.
Đoạn mồi
Primer hay còn gọi là đoạn mồi - là một sợi nucleicacid (hoặc ribonucleic acid) dùng để làm đoạn khởi đầu cho quá trình nhân đôi của DNA. Hầu hết DNA polymerase (enzyme xúc tác quá trình nhân đôi DNA) không thể bắt đầu tổng hợp một đoạn DNA mới mà thiếu primer. Vì nó chỉ gắn các nucleotide vào sợi primer có sẵn theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn.
Trong hầu hết quá trình sao chép DNA tự nhiên, mồi cơ bản cho việc tổng hợp DNA là sợi RNA ngắn. RNA này được tạo ra bởi RNA polymerase, nó được loại bỏ đi và được thay thế bằng DNA bởi DNA polymerase.Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử liên quan đến DNA polymerase, như kỹ thuật xác định trình tự DNA và PCR, cần đến mồi. Mồi dùng cho kỹ thuật này thường ngắn (# 20 base), là các phân tử DNA được tổng hợp nhân tạo.
Cấu trúc thật của mồi bắt đầu bằng 3'-hydroxyl nucleoside gắn với một tên gọi CPG (controlled-pore glass). Đầu 5'-hydroxyl nucleoside được dimethoxytrityl (DMT) bao phủ nhằm ngăn sự thành lập chuỗi nucleotide. Để thêm vào 1 nucleotide thì phải loại bỏ DMT theo cách hóa học, và 1 nucleotide được thêm vào. Đầu 5'-hydroxyl của nucleotide mới bị khóa lại bởi DMT nhằm ngăn chặn sự gắn thêm vào 1 hay nhiều nucleotide trên 1 chuỗi.
Sau đó, chu trình được lặo lại đối với mỗi nucleotide bằng 1 mồi. Đây chỉ là mô tả đơn giản, còn quy trình thực tế thì khá phức tạp. Vì thế, hầu hết các phòng thí nghiệm đều không tạo mồi trên chính nó.
Hình 5. Mô hình đưa mồi vào bắt cặp Nguồn: The DNA Universal, 2022
Việc xác định trình tự DNA được dùng để xác định nucleotide trong sợi DNA. Phương pháp xác định trình tự được gọi là xác định trình tự dideoxy (hay còn gọi là phương pháp Sanger) dùng mồi làm marker khởi đầu cho phản ứng chuỗi.Trong PCR, mồi dùng để xác định các phân đoạn DNA mà được khuếch đại bởi PCR. Chiều dài của mồi thường không dài hơn 50 nucleotide (Do DNA thường là sợi đôi, nên chiều dài của nó được đo bằng cặp base.
Chiều dài của DNA sợi đơn được đo bằng base hay nucleotide), và chúng kết hợp chính xác với điểm khởi đầu và kết thúc của phân đoạn DNA được khuếch đại. Chúng gắn khuôn DNA ở điểm khởi đầu và kết thúc, tại đó DNA polymerase gắn và bắt đầu tổng hợp sợi DNA mới.
Việc lựa chọn chiều dài mồi và nhiệt độ nóng chảy của nó dựa vào nguyên lý: Nhiệt độ nóng chảy của mồi là nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của mồi mà sẽ anneal khuôn DNA và cao hơn nhiệt độ làm mồi rời khỏi khuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảy cần tăng lên theo độ dài của mồi. Mồi quá ngắn sẽ làm ủ hay nối dài (anneal) một số vị trí trên khuôn DNA dài, dẫn đến các bản sao không đặc hiệu. Nói cách khác, chiều dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độ làm nóng chảy nó.
Hình 6. Mô hình dễ hiểu về bắt cặp mồi và DNA khuôn ở hai đầu
Nguồn: www.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr
Nhiệt độ nóng chảy quá cao, nghĩa là trên 80°C, có thể gây ra một số vấn đề do DNA polymerase ít hoạt động ở nhiệt độ này. Chiều dài tối ưu của mồi vào khoảng 30-40 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy khoảng 60°C đến 75°C. Một số cách để tính nhiệt độ nóng chảy (TM) của mồi.
Đôi khi cũng sử dụng mồi phân giải là một hỗn hợp mồi giống nhau, nhưng chưa xác định. Chúng có thể thích hợp nếu gen giống nhau được khuếch đại từ các sinh vật khác nhau. Có các cách sử dụng khác đối với mồi phân giải là khi mồi thiết kế dựa vào trình tự protein. Một số codon khác nhau có thể mã hóa cho một amino acid. Vì vậy trình tự mồi tương ứng với amino acid isoleucine có thể là "ATH", trong đó A thay cho adenine, T cho thymine và H adenine, thymine, hoặc cytosine. Sử dụng mồi phân giải có thể làm giảm tính đặc hiệu của PCR.
(còn nữa) --> Phần tiếp theo: Một số xét nghiệm sinh học phân tử trong nghiên cứu một số bệnh truyền nhiễm ở người (tiếp theo)
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang & TS. Nguyễn Thị Liên Hạnh
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn