Từ việc sử dụng thuốc điều trị đến diễn tiến kháng thuốc
Praziquantel (PZQ) là thuốc thông dụng nhất trong điều trị bệnh sán máng ở người, vì hoạt tính tác dụng của chúng chống lại được tất cả chủng sán máng (Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. intercalatum và S. mekongi). Trên thực địa, đặc biệt điều trị tại cộng đồng, với liều dùng 40 mg/kg liều duy nhất; liều cao hoặc liều chia đôi sẽ dẫn đến sự phối hợp hoặc chấp nhận của cộng đồng thấp hơn. Đối với bệnh nhân nhập viện điều trị, đặc biệt nhiễmS. japonicum và S. mekongi và nhiễm nặng với các chủng khác, liều khuyến cáo là 30 mg/kg, dùng 3 lần mỗi ngày, trong 2 ngày liên tiếp. Thuốc dùng an toàn, tác dụng phụ không đáng kể; trong nhiễm nặng S. mansoni, đau bụng co thắt cấp tính và tiêu chảy ra máu là thường xuyên chứ không phải thoáng qua. CR với liều 40 mg/kg thường khoảng 70-90%; Tỷ lệ giảm trứng ERR trên 90%..
Trong những vùng lưu hành, tái nhiễm là quy luật không phải ngoại lệ, đặc biệt ở trẻ em là những đối tượngphơi nhiễm với nguồn bệnh nặng nhất (bẩm sinh hoặc có miễn dịch) thường nhạy cảm với nhiễm trùng hơn là người lớn. Tuy nhiên, khi cường độ nhiễm và thời gian nhiễm giảm thì điều trị sẽ làm giảm tỷ lệ bệnh tật và diễn tiến bệnh ít phức tạp hơn.
Một vài loại và biệt dược thuốc gốc của PZQ có sẵn trên thị trường. Mặc dù khonog có chỉ định và lưu ý về mặt thuốc kém chất lượng, một vài sản phẩm có nguồn gốc không rõ ràng; người ta khuyên nên lựa chọn các sản phẩm nổi tiếng hoặc hoặc công ty bán sỉ dược phẩm có quy trình kiểm tra chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn quốc tế. Sự cạnh tranh mang tầm cỡ quốc tế đã khiến cho giá thuốc dao động cao ban đầu là 40 cents/ một liều trung bình. Do đó, Tổ chức y tế thế giới (WHO)gần đây đã kêu gọi một nổ lực nhằm đem lại thuốc chất lượng đến tất cả hệ thống y tế cơ sở.
Tại một số quốc gia có lưu hành bệnh này, thuốc không chỉ có mặt khắp nơi để điều trị mà còn dùng để phòng bệnh một cách rộng rãi và không tuân thủ nghiêm ngặt gì. Điều trị dựa vào cộng đồng sau khi đã sàng lọc bệnh nhân thông qua việc điều trị hàng loạt một cách bừa bãi (indiscriminate mass treatment) hoặc điều trị nhóm đặc biệt hiện nay là vấn đề chiến lược chính ở Ai Cập, Trung Quốc,Brazil, Philippine và một số quốc gia khác. Chẳng hạn, tất cả trẻ em lứa tuổi học đường và hàng triệu người lớn được sàng lọc và nếu cần thiết có thể điều trị mỗi 6-12 tháng ở Ai Cập. Trong những vùng lưu hành bệnh cao, thì hiện tại cho điều trị háng loạt một cách bừa bãi toàn dân. Một trong những vấn đề liên quan đến điều này sẽ dẫn đến gây áp lực thuốc cao, hệ thống giám sát thuốc của quốc gia đã thiết lập, trong đó các mẫu phân từ những bệnh nhân thất bại điều trị rõ ràng sẽ được gửi đến trung tâm nghiên cứu vùng để đối chiếu và thực hiện test in vivo và in vitro.
Oxamniquine được cho dùng với liều 15-40 mg/kg có hoạt tính chống lại chỉ với S. mansoni, với tỷ lệ sạch trứng CR (>80%) và tỷ lệ giảm trứng ERR (>95%) thường có mức độ cao hơn thuốc PZQ một ít. Mặc dù thuốc an toàn, song oxamniquine có thể có tác dụng phụ khó chịu ở một vài cá nhân, như là chóng mặt nghiêm trọng, ngủ gà, động kinh. Thuốc thường dùng ở Brazil và không có trên thị trường châu Phi bởi vì ưu thế của thuốc PZQ trên thị trường rất lớn.
Metrifonate là một thuốc không đắt tiền, hoạt tính tác dụng chống lại chỉ S. haematobium, thuốc có sẵn nhưng từ lâu đã không còn sử dụng để điều trị bệnh sán máng. Do vậy, hiện chỉ có một loại thuốc duy nhất dùng điều trị cho bệnh này là PZQ. Thuốc lựa chọn thay thế duy nhất làoxamniquine, hoạt tính chống lại chỉ S. mansoni. Vì vậy, xuất hiện kháng thuốc là một điều khủng khiếp trong thời gian đến, không chỉ cho công tác phòng chống bệnh mà còn giảm hiệu lực điều trị trong thực hành lâm sàng.
Những số liệu liên quan kháng thuốc điều trị sán máng
Tương tự như các loài nematode, người ta lưu ý về tỷ lệ CR và ERR trong thử nghiệm lâm sàng với bất kỳ thuốc nào điều trị sán máng hiếm khi đạt đến 100%, thậm chí ở những vùng mà tình huống tái nhiễm đã được loại trừ. Ngoài ra, tỷ lệ chữa khỏi đã được báo cáo thường vượt quá con số thật của CR. Nhiều trường hợp nhiễm trùng nhẹ (vớiEPGs dưới ngưỡng phát hiện của các kỹ thuật xét nghiệm phân) mà lại tồn tại sau điều trị không phát hiện được bởi các phương pháp chẩn đoán thông thường nhưng đòi hỏi xét nghiệm lại hoặc các xét nghiệm có độ nhạy cao. Do đó, liều khuyến cáo điều trị sán máng nên được cân nhắc dưới liều điều trị khỏi (subcurative). Theo các số liệu này, thuốc rất an toàn trong cả quần thể sán máng, một vài ký sinh trùng đơn độc dung nạp với thuốc ở một vài mức độ khác nhau, ít nhất là ở liều thông thường.
Không giống như nematodes, các phương pháp đếm trứng ký sinh trùng rất mạnh đã có sẵn cho bệnh sán máng, như làKato-Katz để đếm trứng trong phân và lọc nước tiểu. Ngoài ra, việc phát hiện và định lượng kháng nguyên lưu hành trong máu và nước tiểu đã bổ sung cho các công cụ khác để đánh giá hiệu lực thuốc. Mặt khác, lượng trứng thay đổi theo từng ngày và nồng độ kháng nguyên là thay đổi đáng kể; chẳng hạn, hệ số coefficient của sự thay đổi EPGs trong 7 ngày xét nghiệm phân liên tục thay đổi từ 28- 245% và sự liên quan giữa số lượng sán trong máu và đếm trứng in phân và nước tiểu (chất bài tiết) chỉ là gián tiếp và thống kê tính toán sẽ phức tạp hơn trong đánh giá của nematodes.
Sán máng kháng thuốc oxamniquine được báo cáo không rõ ràng cả trên in vivo và in vitro . Về mặt dịch tễ học, hiện tượng này vẫn đứng vị trí quan trọng rải rác ở một số vùng tại Brazil. Có lẽ, các dòng kháng bất lợi với ký sinh trùng sống sót và /hoặc sinh sản thêm sán; cũng như vậy, quá trình đột biến có thể thật sự xảy ra do phơi nhiễm giữa sán máng với thuốc oxamniquine. Tập hợp các yếu tố này lại thì chúng ta giải thích được quá trình tự giới hạn ngay cả dưới điều kiện áp lực thuốc. Vì sử dụng oxamniquine lượng lớn sau thời gian có hiện tượng nên đã được thay thế bằng PZQ ở Brazil và khángoxamniquine ở đó lại không được xem là vấn đề cần quan tâm.
Những báo cáo gần đây có thể liên đới đến khả năng phát triển kháng thuốc PZQ đã khiến người ta lo lắng nhiều, đặc biệt từ khi thuốc này là tâm điểm chính trong chiến lược phòng chống nhằm mục đích giảm tỷ lệ bệnh tật thông qua việc điều trị dựa vào cộng đồng. Báo cáo nghiên cứu thực địa đầu tiên là một nghiên cứu tập trung vùng dịch, cường độ nhiễm cao và mới ở phía Bắc Senegal. Trong một cộng đồng với tỷ lệ lưu hành bệnh và cường độ nhiễm cao đáng kể, tỷ lệ sạch trứng chỉ 18% sau khi dùng PZQ, thấp hơn nhiều so với các báo cáo trước đây (ngay cả vùng có cường độ nhiễm tương đương). Tuy nhiên, tỷ lệ ERR vẫn cao hơn 80%. Nhiễm trùng ban đầu nặng, lan truyền cao,ký sinh trùng tiềm tàng và miễn dịch sơ khởi làm cho chúng ta giải thích tốt nhất cho những tỷ lệ CR thấp. tuy nhiên, khả năng kháng hoặc dung nạp thuốc không thể loạitrừ. Một giả thuyết khác là trong những vùng lưu hành như thế, một quần thể ký sinh trùng dòng hóa / vô tính (clonal parasite population) thì có thể bật mạnh từ những con sán dung nạp.
Vấn đề được khảo sát thêm qua một loạt nghiêm cứu thực địa một cách hệ thống, kết quảđược tóm tắt một cách hệ thống như sau:(i) Tỷ lệ CR thấp với PZQ ở liều 40 mg/kg (18-36%) trên thực địa được xác định trong 4 nghiên cứu hồi cứu, bao gồm các lứa tuổi, cường độ nhiễm, mùa truyền bệnh, thời gian điều tra khác nhau và đo nồng độ kháng nguyên lưu hành. (ii) Tỷ lệ CR vẫn thấp bất thường khi liều thuốc tăng lên hai liều liên tiếp 30 mg/kg khoảng cách dùng liều là 16 giờ. Tuy nhiên, tỷ lệ CR đối với thuốc oxamniquine liều 20 mg/kg liều đơn lại bình thường (84%). (iii) CR với thuốcPZQ liều 40 mg/kg tăng đến bình thường khi điều trị lặp lại 2-4 tháng và cũng bình thường ở trẻ em từ các vùng lưu hành bệnh nhưng sống ở đô thị (nơi không có lan truyền) [108]; A. Mbaye, D. Engels, L. Tchuente, và B. Gryseels, kết quả chưa công bố). (iv) Hiệu lực của PZQ có thể liên quan đến tuổi và cường độ nhiễm trước điều trịnhưng không liên quan đến các yếu tố vật chủ, bao gồm hành vi và thông số miễn dịch. (v) Áp dụng một phương pháp thống kê đếm trứnggiun sán có độ chính xác cao cho thấy rằngtỷ lệ CR thấp có thể giải thích bởi cường độ nhiễm cao ban đầu, ngay cả nếu trên 95% số sán bị diệt (S. J. de Vlas, D. Engels, A. Mbaye, and B. Gryseels, Schistosomiasis Res. Project Conf. Proc., p. 211, 1998).
Qua các nghiên cứu trên có thể rút ra kết luận rằng không có bằng chứng thực địa nào tin chắc làm giảm độ nhạy cảm thuốc của S. mansoni với PZQ và tỷ lệ CR thấp có thể giải thích do tình hình dịch tễ học đặc biệt. May thay, không có thử nghiẹm in vitro nào có sẵn để xác định kháng thuốc PZQ. Thực tế, một vấn đề chính trong phát triển một thử nghiệm kháng thuốc như thế làhoàn toàn cần thiết đúng đắn thiếu dòng schistosome tham chiếu đó là kháng.
Một vài nghiên cứu in vivo thực nghiệm gần đây tiến hành để làm sáng tỏ vấn đề ở Senegal. Nói một cách tóm tắt, các nghiên cứu này như sau: (i) Có thể lựa chọn từ một tập hợp các dòng S. mansoni trong nhiều năm ở phòng thí nghiệm cho một quần thể ký sinh trùng mà hầu hết chúng không nhạy với thuốc PZQ treatment. Tuy nhiên, người ta được các kết quả này có thể giải thích bởi protocol thực nghiệm trên những con chuột được điều trị sau 35 ngày nhiễm. Dòng ký sinh trùng với thời gian trưởng thành chậm hơn sẽ không nhạy với PZQ ở thời điểm đó và sẽ được lựa chọndưới áp lực thuốc như một dòng kháng. (ii) Trong cùng một protocol, một dòng Senegalese hoang dại dường nhưu ít nhạy với PZQ. Một cách đáng lưu ý, quan sát này sẽ không chắc chắn với ERR cao khi thử trên thực địa, cho thấy giảm nhạy ở hầu hết các ký sinh trùng. Nói một cách khác, kết quả này có thể là do con ngườii tạo ra của điều trị sớm trên các con chuột bị nhiễm.Những nghiên cứu tiếp theo điều trị sau 60 ngày cho nhiễm thực nghiệm cho thấy nó gia tăng đáng kể về hiệu lực, mặc dù có thấp hơn một số dòng ở vùng địa lý khác. (iii) Tại labo khác, các schistososomes được phân lập từ bệnh nhân người Senegal đã được thực hiện điều trị vài lần trước đó nhưng vẫn đào thải trứng không cho thấy bát kỳ dấu hiệu nào giảm nhạy với PZQ.
Những quan sát tiếp theo ở thực địa tỷ lệ chữa khỏi thấp khi điều trị bằng PZQ rõ ràng có thể giải thích theo thống kê bởi gánh nặng sán ban đầu cao và nhiễm thể chưa trưởng thành nặng (thì khi dùng PZQ không có hiệu quả), trong phối hợp với các giới hạn vốn có trong hệ thống chẩn đoán. Về mặt sinh học, giả thuyết này hỗ trợ bởi mức độ kháng nguyên lưu hành cao (chỉ ra rằng nhiễm nặng) và kết quả điều trị lặp lại và điều trị ở những vùng khong có lưu hành bệnh thì nó cho tỷ lệ chữa khỏi bình thường. Kết quả “bình thường” với thuốc oxamniquine có thể giải thích theo thống kê bằng một hiệu lực diệt sán máng mạnh vốn có của chúng. Những kết quả thực nghiệm trên chuột hoàn toàn trái ngược; chỉ có những phương pháp như thế mới khong thể chối cải được về giảm độ nhạy trong những dòng ký sinh trùng thuộc các vùng địa lý khác nhau. Mặc dù khác nhau về mặt địa lý trong nhạy cảm thuốc, song không thể làm rõ với thuốc PZQ, người ta biết rất rõ làhycanthone và oxamniquine đã dẫn đến liều khuyến cao đặc hiệu cho từng vùng.
Nếu vì lý do nào đó, các nghiên cứu này dẫn đến kết luận rằng chỉ có một sự giảm nhạy có thể phát hiện đáng tin cậy là bằng các phuwng phpá nghiên cứu thực địa. Xác định kháng thuốc tại labo vẫn còn hứa hẹn do thiếu thiết bị và tiêu chuẩn hóa để đánh giá. Những nổ lực trên thế giới ít ra đã thiết lập một vài protocol và phối hợp thu thập dữ liệu và thiết bị nhằm đầu tư cho nghiên cứu là hướng đang mở ra.
Ngoài ra, các báo cáo về thử nghiệm lâm sàng và thực nghiệm tử Ai Cập, một vùng lưu hành bệnh do sử dụng thuốc rộng rãi có thểquyết định cho sự xuất hiện kháng PZQ. Một hệ thống giám sát toàn quốc được bắt đầu để phát hiện và điều tra những ca mà PZQ không điều trị khỏi, ngay cả sau khi điều trị lặp lại. Từ nhiều ca, đến một số đông trong một vùng địa lý, ký sinh trùng đựoc phân lập cho thấy có sự giảm nhạy ở chuột và trên in vitro so với những dòng sán đối chiếu ở người Ai Cập. Một mặt, thiếu các phương pháp chẩn hóa, đặc biệt là in vitro, chưa cho phép xác định và kết luận. Tuy nhiên, thì ít nhất các chủng giảm nhạy (và có thể là luôn luôn) có mặt và nổi lên dưới áp lực thuốc thì không thể loại trừ.
Cơ chế kháng thuốc ở loài sán máng
Di truyền về kháng thuốc của sán máng với oxamniquine được biết thấu đáo, nhưng điều này lại chưa rõ ràng đối với trường hợp sán máng với PZQ. Ngược với sự phát triển và hình thành cơ chế kháng thuốc cổ điển ở giun sán, thì điều này lại lan rộng dần dần trong cả quần thể như hậu quả tất yếu của sự lựa chọn kiểu hình kháng thuốc ở tần số thấp, kháng với thuốc hycanthone-oxamniquine xuất hiện quy mô toàn cầu lần đầu tiên như thế hệ cha truyền con nối của các KST đã phơi nhiễm với thuốc. Hướng đề nghị cho rằng kháng thuốc gây ra hơn là lựa chọn từ các thể đã tồn tại từ trước, thử nghiệm sinh sản chéo đã làm rõ về kháng thuốc oxamniquine được kiểm chứng bởi một gen lặn nhiễm sắc thể thường (Cioli và cs; Pica-Mattocia và cs.,2000). Kháng oxamniquine không dễ dàng lan rộng trong cộng đồng nhưng có xu hướng duy trì trên một số cá thể có giới hạn. Theo Cioli và cs, điều này có thể do các bất lợi của lựa chọn kháng thuốc do sán máng trong khi không có áp lực thuốc, thực tế kháng là do tự nó hơn là do lựa chọn.
Một số ít biết về nền tảng di truyền và sinh hóa của kháng vớiPZQ. Gần đây, sự phân địnhvề di truyền được làm rõ giữa dòng KST sán mángS. mansoni trong labô được lựa chọn cho kháng với PZQ và dòng nhạy của thế hệ cha mẹ. Mặc dù các tác giả này không phát hiện bất kỳ một sự tái sắp xếp bộ gen chính nào trên những dòng KST này, giải mã mRNA một đoạn của subunit1 của enzyme cytochrome oxidase trải rộng ra gấp 5-10 lần trên những dòng kháng so với dòng nhạy. Các nghiên cứu tiếp theo là cần thiết để kiểm tra có hay không một hiện tượng tương tự cũng hiện diện trong những dòng này tại thực địa mà nghi ngờ là kháng thuốc PZQ và những gen kháng cũng biểu hiện khác biệt trên những dòng kháng của sán máng S. mansoni.
Di truyền về kháng thuốc ở sán máng
-Di truyền về kháng thuốc của sán máng với oxamniquine được biết thấu đáo, nhưng điều này lại chưa rõ ràng đối với trường hợp sán máng với PZQ. Ngược với sự phát triển và hình thành cơ chế kháng thuốc cổ điển ở giun sán, thì điều này lại lan rộng dần dần trong cả quần thể như hậu quả tất yếu của sự lựa chọn kiểu hình kháng thuốc ở tần số thấp, kháng với thuốc hycanthone-oxamniquine xuất hiện quy mô toàn cầu lần đầu tiên như thế hệ cha truyền con nối của các KST đã phơi nhiễm với thuốc;
-Hướng đề nghị cho rằng kháng thuốc gây ra hơn là lựa chọn từ các thể đã tồn tại từ trước, thử nghiệm sinh sản chéo đã làm rõ về kháng thuốc oxamniquine được kiểm chứng bởi một gen lặn nhiễm sắc thể thường (Cioli và cs; Pica-Mattocia và cs.,2000). Kháng oxamniquine không dễ dàng lan rộng trong cộng đồng nhưng có xu hướng duy trì trên một số cá thể có giới hạn. Theo Cioli và cs, điều này có thể do các bất lợi của lựa chọn kháng thuốc do sán máng trong khi không có áp lực thuốc, thực tế kháng là do tự nó hơn là do lựa chọn;
-Một số ít biết về nền tảng di truyền và sinh hóa của kháng vớiPZQ. Gần đây, sự phân định về di truyền được làm rõ giữa dòng KST sán mángS. mansoni trong labô được lựa chọn cho kháng với PZQ và dòng nhạy của thế hệ cha mẹ. Mặc dù các tác giả này không phát hiện bất kỳ một sự tái sắp xếp bộ gen chính nào trên những dòng KST này, giải mã mRNA một đoạn của subunit1 của enzyme cytochrome oxidase trải rộng ra gấp 5-10 lần trên những dòng kháng so với dòng nhạy. Các nghiên cứu tiếp theo là cần thiết để kiểm tra có hay không một hiện tượng tương tự cũng hiện diện trong những dòng này tại thực địa mà nghi ngờ là kháng thuốc PZQ và những gen kháng cũng biểu hiện khác biệt trên những dòng kháng của sán máng S. mansoni.
Phát hiện kháng thuốc:
Thử nghiệm đếm trứng giảm đi trong phân (FECRT_Fecal egg count reduction test)
Test để phát hiện KTGS cho phép so sánh trước và sau khi điều trị với một loại thuốc chống giun sán. Một đề cương chuẩn để áp dụng choFECRT đã có sẵn cho các loại giun tròn có tầm quan trọng về mặt thú y. Trên động vật nhai lại, những mẫu phân được lấy từ hai nhóm ít nhất của 15 con, chọn những con còn non hơn được nuôi trên nông trại và chưa điều trị trước đó 8-12 tuần. Những động vật này được phân bố ngẫu nhiên vào một nhóm điều trị (nghiên cứu) và một nhóm chứng. Những mẫu phân được thu thập từ ngày thứ 10 đến 14 sau điều trị. Để giảm tải công việc, những mẫu phân trước điều trị không lấy (pretreatment samples); điều đó sẽ so sánh giữa nhóm chứng và nhóm sau điều trị (posttreatment) sẽ rất đáng tin cậy khi so sánh trước và sau điều trị. Đếm trứng giun theo phương pháp McMaster chuẩn, đếm lượng trứng/ 1g phân của nhóm chứng sẽ cao hơn 150 thì giá trị so sánh mới hợp lý. Công thức sau được dùng để tính % lượng trứng giảm:
ERR = 100(1Xt/Xc),
X là trung bình số học EPG;
c và t lần lượt là nhóm chứng và nhóm điều trị.
-Theo hướng dẫn của WAAVP, kháng thuốc giun sán ở các động vật nhai lại được công nhân khi ERR <95% và độ tin cậy (CI< 95%) là < 90%. Nếu 1 trong 2 tiểu chuẩn này đạt thì kháng thuốc khi đó được nghi ngờ;
-Protocol này hướng dẫn triển khai một tiếp cận chuẩn cho kháng thuốc giun sán ở người, nhưng phải có sự thay đổi bởi vì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa động vật và người. Để bắt đầu điều này, các đối tượng nghiên cứu phải khác: ở gia súc, thử nghiệm được sử dụng xác định thường quy tại chỗ để biết kháng thuốc; song trên người, những thử thách vẫn còn đó khiến cho kháng thuốc tồn tại. Ngoài ra, quần thể nghiên cứu người thì dị hợp hơn nhiều so với động vật: có một sự thiếu phối hợp trong quy trình theo dõi, thu thập mẫu làm bằng chứng, hành vi của cá nhân (liên quan đến phơi nhiễm cũng như những hành vi liên quan đến sức khỏe) có thể tác động quan trọng trên các thông số thử nghiệm hoặc chủng giun nhiễm vào người khác cho nên đòi hỏi có phương pháp xét nghiệm phân khác;
-Vấn đề phương pháp nghiên cứu đã được trải nghiệm trong quá khứ để xác định kháng thuốc giun sán trên người, một protocol chuẩn để phát hiện kháng thuốc trên người dưới điều kiện thực địa có thể bao gồm một số yếu tố chuẩn hóa như nhóm nghiên cứu và phương pháp ký sinh trùng.
(i)Nhóm nghiên cứu và nhóm chứng (Study and control groups)
Những nghiên cứu để xác định các trường hợp nghi ngờ kháng thuốc, đặc biệt thuốc là hợp chất thì chưa bao giờ có báo cáo nào đáng tin cậy, nên phải gồm ít nhất 1 nhóm điều trị (nghiên cứu) và một nhóm không điều trị (placebo);
-Tốt hơn, một nhóm chứng dương tính, điều trị với một nhóm khác, không liên quan và dự đoán hiệu lực thuốc cũng nên đưa vào tiêu chuẩn. Các thuốc nên có nguồn gốc rõ ràng và chất lượng tốt; các khuyến cáo này nên đưa vào sử dụng trên lâm sàng, không nên sử dụng dưới liều (subcurative doses) mà áp dụng vào trong việc phòng chống bệnh dựa vào cộng đồng, với liều thích ứng cho từng trọng lượng cơ thể;
-Thuốc phải nuốt dưới sự giám sát trực tiếp; đặc biệt dùng syrup hoặc dạng nhũ dịch với lượng thích hợp cho trẻ em. Những người bị nôn hoặc tiêu chảy nặng trong thời gian ngắn từ khi uống thuốc điều trị sẽ loại khỏi nghiên cứu thuần tập. Ngoại trừ lý do độc tính của thuốc, phụ nữ có thai và những người có bệnh hệ thống cũng nên loại trừ vì động lực của miễn dịch KST cũng như dược lý học có khả năng làm nhiễu các thông số theo dõi;
-Các nghiên cứu dược động học không cần thiết từ ban đầu nhưng nên thực hiện trước khi kết luận về kháng thuốc;
-Cỡ mẫu xác định bằng cách dùng 1 phân tích thống kê đa năng dựa trên giả thuyết định lượng; chẳng hạn, với mỗi thuốc điều trị giun sán được thử nghiệm, giá trị CR và ERR nên xác định trước. Vì như vậy, sẽ làm rõ các bàn luận ở trên;
-Thành phần nhóm nghiên cứu phải tương đồng về mặt thống kê tuổi, giới, số lượng trứng đếm trung bình trước khi điều trị và ngay cả phân bố trung bình. Trẻ em và người lớn nên tính toán vào các quần thể khác nhau. Các yếu tố nhiễu khác có khả năng đưa đến như yếu tố phân lớp kinh tế xã hội, nghề nghiệp, tôn giáo, lứa tuổi đi học để chúng ta loại trừ bớt;
-Một cách lý tưởng là các nhóm nên lựa chọn từ nhiều hơn hoặc ít hơn quần thể dị hợp (heterogeneous population), chẳng hạn một làng và phải nghiên cứu đồng thời để tránh sự khác biệt về không gian và thời gian lan truyền bệnh. Không có đối tượng nào trong nghiên cứu nhận điều trị với bất kỳ một thuốc giun sán hoặc hợp chất trong 3 tháng trước (đối với giun tròn) và 12 tháng (đối với sán máng), vì như thế có thể ảnh hưởng quy trình của sự tái lập lượng KST trong số họ;
-Đưa ra những yêu cầu và tỷ lệ loại khỏi nghiên cứu của các đối tượng; cỡ mẫu ban đầu nên ít hơn 50/1 nhóm nghiên cứu, nếu chỉ đối với các thử nghiệm có giá trị cho mô hình phân phối của đếm trứng. Trứng đếm trước điều trị nên đủ lớn để phiên giải kết quả có ý nghĩa thống kê;
-Khía cạnh y đức phải được nêu ra (bản đồng ý của đối tượng, cha mẹ hoặc người giám hộ), điều trị cho những ca chứng (-) ngay sau khi theo dõi hoặc sớm hơn nếu tình trạng lâm sàng cần thiết điều trị; quản lý và giám sát các tác dụng phụ, cho nhập viện kịp thời nếu cần thiết.
(ii)Phương pháp xét nghiệm ký sinh trùng trong đánh giá kháng thuốc
-Một kỹ thuật đếm trứng chuẩn nên áp dụng để xác định lượng trứng trong phân (epg) của mỗi cá nhân. Đối với sán máng, giun đũa và giun tóc thì phương pháp chuẩn là kỹ thuật Kato ( Peters và cs; Polderman và cs). Các lam phân được bảo quản cẩn thận để đối chiếu và kiểm tra chất lượng sau đó;
-Với giun móc, hết sức cẩn thận với kỹ thuật Kato chuẩn xác. Tác giả Martin và Beaver khuyên nên đọc kết quả lam sau 30 phút và không được sau hơn 60 phút sau khi làm lam kính xong vì cả hai đều làm ảnh hưởng hoặc nhiễu giá trị. Song, điều này dựa trên một vài mẫu phân trên lâm sàng thì được nhưng ở thực địa, tính ổn định và độ trong suốt của mẫu phân có thể khác nhau giữa nghiên cứu trên cá nhân và cộng đồng. Bất kỳ trường hợp nào, lam phân Kato có lượng phân hơn 25mg như trong kỹ thuật Kato-Katz chuẩn, có thể sẽ khó đọc kết quả sau 1 giờ và vì vậy không phù hợp cho nghiên cứu đếm trứng giun móc chuẩn xác được. Đọc tất cả lam phân trong một khoảng thời gian ngắn sau khi chuẩn bị đòi hỏi các nhà nghiên cứu ở thực địa chuẩn bị và tổ chức một cách khoa học;
-Một cách lý tưởng, kỹ thuật Kato đáp ứng nhu cầu cho đếm trứng giun móc có thể bảo tồn tính cổ điển hoặc cải cách so với FECRT trong lĩnh vực thú y. Nhu cầu lớn đòi hỏi để triển khai là tính khách quan và tính hợp lệ cho một protocol chuẩn mà không cần thêm nghiên cứu thực địa về kháng thuốc giun sán trên giun móc sẽ vẫn là khiếm khuyết nghiêm trọng. Đếm trứng sẽ cho thấy khác nhau từ ngày này qua ngày khác, giữa cá nhân này với cá nhân khác và tại chính cá nhân đó rõ nét trên cả giun tròn và sán máng. Để thu thập trứng sán máng chính xác hơn ở mức độ cá nhân, tối thiểu phải 3 mẫu phân được lấy để xét nghiệm;
-Nếu tập trung vào chỉ số CR (khỏi bệnh), phương pháp định lượng trứng trong phân nhạy nhất nên áp dụng kết hợp với 1 phương pháp định lượng khác như phương pháp lắng có glycerine cho sán máng và cấy phân cho giun móc. Phương pháp định tính là cần thiết làm trên những mẫu phân bổ sung để xác định chính xác.
-Phiên giải kết quả đếm số lượng trứng trung bình theo thống kê rất phức tạp.Tính chính xác trong khoa học đòi hỏi sử dụng mô thức liên quan giữa đếm trứng giun với lượng giun trên người, thông số kết quả của điều trị sẵn có. Sử dụng trực tiếp chỉ số EPG cho ta một mối liên quan tỷ lệ, mà điều này không hề đúng với thống kê học và sinh học. Công cụ thống kê thực hành để mà kết luận không bao giờ cũng dễ và sẵn có mà chỉ có ở loài sán máng. Nói một cách đơn giản, số lượng trứng trung bình có thể áp dụng để phân tích số liệu thô ban đầu và có đủ để loại giả thuyết kháng thuốc hay không. Tuy nhiên, những kinh nghiệm tiến hành ở người Senegal với thuốc PZQ lại đươc phân tích một cách chi tiết hơn. Trong khoa học thú y, trung bình số học của trứng đếm được áp dụng hơn là trung bình hình học bởi lẽ chúng sẽ nhạy hơn và cho phép phát hiện KTGS sớm hơn. Điều này có thể chính đáng trong những tình huống nơi mà KTGS được biết tồn tại; tuy nhiên, về mặt thống kê thì trung bình số học lại không có giá trị do đếm trứng giun sán tập trung, kếp tập lại quá chặt, điều này thường theo một phân bố nhị thức âm tính (negative binomial distribution). Trung bình hình học thích hợp hơn mặc dù chưa lý tưởng lắm vì mô hình phân bố thay đổi sau khi chúng ta can thiệp;
-Khoảng cách thời gian mỗi lần điều trị và thu thập mẫu phân phải thích hợp cho từng chủng loại KST và từng loại thuốc sử dụng. Chẳng hạn, để đánh giá hiệu quả thuốc nhóm BZ trong điều trị giun móc/ mỏ, một khoảng cách khoảng 2 tuần là thích hợp, thời gian lâu hơn sẽ cho phép thể chưa trưởng thành thậm chí một nhiễm mới trở nên là nguồn KST khó xác định và ngược lại khoảng thời gian ngắn hơn sẽ cho chúng ta đánh giá quá mức về hiệu lực thuốc (overestimate efficacy), vì một vài thuốc tạm thời ức chế sinh sản trứng mà không thể giết chết giun sán;
-Đối với sán máng, vấn đề phân biệt thể hoạt động với thể chưa trưởng thành hoặc thậm chí tình trạng nhiễm trong quá khứ đến mức độ nào đó sẽ rất phức tạp. Vì sán sống trong mạch máu nhỏ, trứng sán chảy theo một đường từ vi trí trong tĩnh mạchđến bên ngoài và có thể thải trứng đến 6-8 tuần hoặc thậm chí dài hơn sau khi sự sinh sản của chúng bắt đầu. Phương pháp Kato không phân biệt được trứng đã chết hay còn sống. Mặc khác, nhiễm các thể chưa trưởng thành, điều này không ảnh hưởng bởi PZQ, có thể trở nên rõ ràng ở nhiều ngày sau khi điều trị thành công sán trưởng thành và nhiễm KST gần đây có thể dẫn đến đào thải trứng trong vòng 4-6 tuần;
-Giải pháp lý tưởng cân nhắc các bệnh nhân đang nằm ngoài vùng lưu hành và để đánh giá chữa khỏi sau 8-12 tuần hoặc thậm chí dài hơn. Thực tế, điều này chỉ xảy ra cho các du khách là những người thường nhiễm nhẹ không biểu hiện triệu chứng. Tuy nhiên, kết quả phải luôn phiên giải và chú ý đến khả năng tái nhiễm nhẹ (gồm sự trưởng thành của các thể tiềm tàng) ở những vùng lan truyền cao. Nếu có thể, thử nghiệm điều trị sẽ xảy ra ở những mùa không lan truyền hoặc lan truyền thấp;
-Việc xác định số lượng kháng nguyên lưu hành, đặc biệt trong huyết thanh có thể đóng vai trò như một công cụ bổ sung hữu ích. Chữa khỏi có thể được đánh giá trong vài ngày đến một tuần sau điều trị nhưng kém nhạy hơn vì tái nhiễm nhanh chóng. Tuy nhiên, phương pháp phát hiện kháng nguyên không thể hoàn toàn kỹ thuật đếm phân, vì 5-30% nhiễm giun sán vẫn còn bỏ sót; kítxét nghiệm kháng nguyên đã sẵn có trên thị trường song về cơ sở hạ tầng labô nhiều hơn phương pháp đếm phân;
-Để rõ ràng từng vấn đề trên với số liệu hợp lệ nhằm xác định KTGS ở thực địa đòi hỏi phải có tính chuyên sâu về KST và dịch tễ học, đội nghiên cứu được đào tạo tốt, tổ chức cẩn thận và kiểm tra chất lượng chặt chẽ và đó là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao và thiết lập các phương pháp phù hợp và protocol chuẩn.
Các thử nghiệm tại labô để phát hiện KTGS trên gia súc
Một số thử nghiệm khác nhau đựợc mô tả để phát hiện KTGS trên gia súc. Một số trong các XN đó có thể áp dụng trong đánh giá KTGS trên người:
(i) Thử nghiệm nở trứng (EHT_Egg hatch test)
-Thử nghiệm làm nở trứng là một thử nghiệm in vitro, chỉ sử dụng để phát hiện kháng thuốc cho nhóm BZ ở gia súc; như thế người ta dựa vào hoạt độ diệt trứng (ovicidal activity) của các phân tử nhóm thuốc này. Thử nghiệm kinh điển do Le Jambre mô tả, 1 protocol chuẩn được đề ra bởi WAAVP. Mẫu phân thu thập phải tươi (trong vòng 3 giờ sau khi đại tiện) khi đó số liệu mới đáng tin cậy. Nếu không thể làm ngay, các mẫu phân phải được cất giữ trong môi trường kỵ khí; khâu cất giữ sẽ không làm ảnh hưởng đến kết quả XN, ít nhất là không làm ảnh hưởng đến các loại giun sán trong đường tiêu hóa của động vật. Trứng giun được làm tinh khiết và ủ trong một loạt các môi trường của thiabendazole (TBZ). Hợp chất này được lựa chọn bởi vì nó hòa tan nhanh chóng trong dimethyl sulfoxide và kháng thuốc thường có mặt một số nhóm thuốc khác với nhóm BZ. Sau 24 giờ, lượng ấu trùng được đẻ ra sẽ cho đếm.
-Khi xuất hiện kháng thuốc, hoạt độ diệt trứng giảm, phần trăm trứng đẻ ra sẽ cao hơn. Dựa vào những kinh nghiệm về thử nghiệm này, tổ chức WAAVP cho biết kháng thuốc xuất hiện khi liều hiệu quả 50% 0.1µg/ml. Điều này trên in vitro có lợi ngay cả chỉ có một mẫu phân.
-FECRT và test đẻ trứngphát hiện KTGS chỉ khi ít nhất 25% quần thể giun sán mang gen kháng thuốc như là gây nhiễm nhân tạo trên những động vật với quần thể giun sán với một mức độ kháng thuốc biết trước. Vì sự trở lại tính nhạy là có thể, miễn là gen kháng thuốc có mặt ít hơn 5% trong tổng số quần thể, FECRT và thử nghiệm đẻ trứng cho phép phát hiện kháng thuốc chỉ khi nào quá muộn để can thiệp vào. Số liệu thực địa và thực nghiệm của giun sán trên gia súc bổ sung chỉ ra sự nhạy trở lại với các thuốc chống giun sán trên gia súc.
(ii) Thử nghiệm phát triển ấu trùng (LDA_Larval development assay)
-Thử nghiệm LDA đòi hỏi chuyên cần và tốn nhiều thời gian hơn thử nghiệm đẻ trứng nhưng cho phép phát hiện kháng với một phổ rộng giun sán (broad-spectrum anthelmintic classes) chủ yếu, bao gồm avermectins-mylbemycins.
-Thử nghiệm LDA được mô tả bởi Coles và cs và được cải tiến bởi một vài tác giả khác thành test thương mại có sẵn trên thị trường. Trong thử nghiệm phát triển ấu trùng, trứng của giun tròn hoặc ấu trùng L1 phơi nhiễm với nồng độ thuốc thuốc giun sán khác nhau không tương ứng với các giếng trên thạch agar nhưng trong các plate thử thuốc. Hiệu quả của thuốc lên trên quá trình phát triển chuyển dạng thành ấu trùng giai đoạn 3. Kết quả liên quan rất chặt chẽ với các thử nghiệm trên in vivo test.Người ta khẳng định thử nghiệm này nhạy hơn FECRT và test đẻ trứng phát hiện kháng thuốc khi 10% quần thể giun mang gen kháng thuốc, nhưng điều này nên mở rộng nghiên cứu để chứng minh.
(iii) Thử nghiệm làm bất động ấu trùng (Larval motility or paralysis test)
-Một vài thử nghiệm in vitro phát hiện kháng thuốc nhóm BZ, macrocyclic lactones hoặc levamisole-morantel đã được mô tả dựa trên tính di động của ấu trùng. Đối với những nhóm thuốc giun sán mới sau này thì để phân tích sự khác biệt giữa dòng nhạy và kháng không phải luôn luôn dễ dàng.
-Một thử nghiệm về tính di động đượcáp dụng để đánh giá độ nhạy của các ấu trùng O. volvulus với thuốc ivermectin. Để phiên giải kết quả trên nhiều đối tượng, một phép đo vi thểđược áp dụng. Folz và cs sử dụng bộ dụng cụ này để phát hiện kháng thuốc trên loài H. contortus và T. colubriformis, nhưng hiệu quả của phương pháp còn chưa tin cậy.
(iii)Kỹ thuật sinh học phân tử PCR (polymerase Chain Reaction technique)
Những mồi đặc hiệu đầu tiên để phát hiện KST giun tròn kháng thuốc được triển khai bởi Kwa và cs. Các mồi này có tính chính xác giữa heterozygous and homozygous của H. contortus kháng BZ đối với các allelel là -tubulin isotype 1, thậm chí khi các kiểu gen này khác biệt về kiểu hình và cũng có thể nhận dạng kháng nhóm BZ của T. colubriformis. Theo Roos và cs, PCR phát hiện 1% cá thể kháng trong một quần thể giun nhạy, chính là ưu điểm hơn in vivo và in vitro test.
-Gần đây, Elard và cs triển khai một phương pháp đơn giản để chẩn đoán kháng thuốc nhóm BZ của O. (Telodorsagia) circumcincta. Sử dụng 4 cặp mồi (2 đặc hiệu alen và 2 đặc hiệu không alen (2 -specific and two nonallele-specific ones) trong cùng một phản ứng PCR, giun trưởng thành được đặc trưng bởi đột biến phân tử 200 của isotype 1 -tubulin tồn lưu. Kỹ thuật nay đã được cải tiến để áp dụng cho từng loại giun, trứng giun riêng biệt hoặc ấu trùng (M. H. Roos, 2000). Vì tần số các alleles liên quan với KTGS có thể rất cao ngay cả trên quần thể KST nhạy, điều đó rất quan trọng nếu chúng ta bổ sung dữ liệu DNA của mỗi loại KST. Nếu DNA được tách chiết từ KST hỗn hợp, thì sự phối hợp giữa các allele đặc biệt có thể sẽ phân tích không có ý nghĩa.
-Vì đột biến giống nhau chịu trách nhiệm việc kháng nhóm thuốc BZ trong nhiều loài giun tròn, phương pháp này có thể cho chúng ta một công cụ điều tra tần số các allele có ưu thế trong số đông ký sinh trùng giun tròn trên người và trên động vật.
-Một sự kỹ thuật phát triển tuyệt vời khác là hiện đã có sẵn các đầu dò gen (P-gp gene probe) cho phát hiện Onchocerca volvulus. Vì nó chỉ ra P-gp đóng một vai trò trong kháng thuốc nhóm BZvà IVM ở H. contortus, người ta hy vọng rằng cơ chế phát hiện kháng thuốc giống nhau có thể phát triển trên nhiều loài giun sán khác trong tương lai.
Thử nghiệm tại labo để phát hiện kháng thuốc giun sán trên người
Trừ test đẻ trứng đối với giun móc/ mỏ ở nghiên cứu Mali, in vitro test cho kháng thuốc ở loài giun tròn trên người có giá trị trong một giới hạn hợp lý nào đó. Vấn đề chính là thiếu dòng kháng để tham khảo. Nếu sẵn có, test đẻ trứng và thử nghiệm phát triển ấu trùng cũng như kỹ thuật PCR dễ dàng đánh giá kháng thuốc trên giun móc/ mỏ ở người.
-Những thử nghiệm tại labo đối với kháng thuốc điều trị sán máng, đặc biệt với PZQ, bao gồm chủ yếu đếm lượng sán giảm đi sau khi điều trị ở mô hình phòng thí nghiệm gây nhiễm trên chuột. Trước tiên, phải nhấn mạnh rằng chuột trắng là vật chủ không phải tự nhiên nhiễm sán máng cao; một lượng sán nằm trong máu là một vật thể lạ khổng lồ trong mạch máu của chuột nhỏ. Tỷ lệ cân xứng là 1 con sán duy nhất trong một con chuột (thể tích máu 5ml) tương ứng với 10.000 con sán trong một người trưởng thành (thể tích máu 5lít máu). Một vài con chuột sống sót với lượng sán nhiều như thế trong thời gian dài đủ cho phép thử nghiệm điều trị, do vậy hiệu lực thống kê vốn đã giới hạn càng giới hạn hơn. Những dòng trong labô thường được duy trì và bảo tồn sử dụng trứng từ những gan chuột bị nhiễm trong 5-6 tuần, dẫn đến lựa chọn KST trưởng thành nhanh chóng hơn và trở nên nhạy với PZQ sớm hơn (hơn cả dòng tự nhiên).;
-Như trên đề cập, sai số như thế có thể giải thích những báo cáo đầu tiên về kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc do điều trị với PZQ ở phòng thí nghiệm. Không dễ dàng gì phân lập các KST hỗn hợp, kháng hay không kháng. Thường thìchuột bị nhiễm một phức hợp cercariae từ ít nhất 5 con ốc để thu thập cả 2 giới có điều kiện sinh sản. Những con ốc này thường phơi nhiễm với 3-5 miracidia, dẫn đến nhiễm phối hợp. Các miracidia này, thậm chí nếu phân lập từ phân của1 người cũng không đáp ứng tốt với điều trị. Vì vậy, việc xác định và đánh giá kháng thuốc trong một mô hình như vậy sẽ rất đơn điệu và công việc tẻ nhạt. Một protocol chuẩn đề ra do Fallon và cs dựa trên quy trình và khuyến cáo của Cioli ởCộng đồng châu Âu họp tại Leiden, Hà Lan rằng tiêu chuẩn hóa có giá trị nhưng mô hình chuột vẫn rất khó để thảo luận, nghiên cứu và phiên giải kết quả sau này.
-Yêu cầu quan trọng trong in vitro test. là sán máng trưởng thành có thể nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, tạo ra cơ hội tuyệt vời để làm rõ trong phơi nhiễm in vitro với sán riêng lẽ. Những thử nghiệm như thế sẽ chính xác hơn nhiều, khả năng sinh sản hơn nhiều và có khả thi hơn mô hình thực nghiệm, cho phép sàng lọc một số lượng lớn sán cũng như xác định các phân lậpđạt yêu cầu. Điều này cho phép nghiên cứu sâu về kháng hycanthone và oxamniquine. Tuy nhiên, đối với PZQ thử nghiệm không thể thiết lập với điều kiện là không có dòng tham khảo kháng thuốc đáng tin cậy;
-Ưu tiên trong nghiên cứu KTGS ở sán máng và sán dây ở người để tiến hành nghiên cứu trên thực địa cộng đồng nơi mà những nghi ngờ về lâm sàng hoặc khía cạnh dịch tễ học phải được đầu tư, nhằm phân lập nhiều cá thể KST từ những bệnh nhân không được chữa khỏi và xác định kết quả trên mô hình thực nghiệm. Một khi những dòng như thế được thiết lập và củng cố thì test in vitro có thể hợp lệ. Từ đó, cho phép thử nhanh trên thực địa nhằm phân lập và nghiên cứu sâu về sinh học cũng như di truyền trong KTGS ở người.