Gần đây, trong quá trình thực hành xét nghiệm chẩn đoán và phát hiện ký sinh trùng sốt rét cũng như đối chiếu với kết quả xét nghiệm bằng que thử nhanh (RDTs) các loại Paracheck P.f hoặc Carestart Malaria pLDH/HRP2 Combo test để chẩn đoán bệnh sốt rét cả trong thực hành điều trị tại Bệnh viện lẫn thực địa và cộng đồng nơi có vùng sốt rét lưu hành, nhiều cán bộ y tế cho rằng đôi khi gặp kết quả trái ngược, nghĩa là khi xét nghiệm lam máu dương tính, mật độ KSTSR rất cao nhưng test nhanh lại âm tính và ngược lại.
Điều này, chúng tôi cũng đã đề cập trong các chuyên mục chẩn đoán bệnh sốt rét trước đây và đưa ra 8 bằng chứng để giải thích các hiện tượng như thế. Song, gần đây chúng tôi có biết thêm một hiện tượng có thể làm thay đổi kết quả xét nghiệm nhanh, hoặc gây ra kết quả âm tính giả trong một số trường hợp. Chúng tôi xin chia sẻ hiện tượng này, có tên là hiện tượng Prozone (Prozone phenomenon) được đề cập khá nhiều trong y văn.
Test chẩn đoán nhanh (RDT) ngày càng được sử dụng rộng rãi vì nó có vai trò thay thế kính hiển vi trong việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sốt rét, đặc biệt tại các vùng sốt rét lưu hành (SRLH) có mạng lưới điểm kính hiển vi chưa bao phủ, nghĩa là vừa yếu lại vừa thiếu. Nguyên lý của phản ứng và cho ra kết quả của các test chẩn đoán nhanh RDTs là dựa trên việc phát hiện kháng nguyên (Ag) của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) có trong máu đã bị ly giải sau đó gắn kết và tạp phức hợp với kháng thể cài đặt sẵn trên que (Ab), bằng phương pháp sắc ký miễn dịch có màu. RDT nhằm vào kháng nguyên đích đặc hiệu hay không đặc hiệu gồm kháng nguyên (KN) đặc hiệu cho Plasmodium falciparum (Histidine-rich protein-2, viết tắt là HRP-2, không nên nhầm lẫn với HRP1 liên quan đến in vitro testing), kháng nguyên LDH đặc hiệu loài P. falciparum (P. falciparum specific parasite Lactate DeHydrogenase, hay Pf-pLDH), kháng nguyên đặc hiệu cho P. vivax (P. vivax-specific parasite Lactate DeHydrogenase, Pv-pLDH) và kháng nguyên chung cho các loài Plasmodium spp. gồm P. falciparum, P. vivax, P. ovale và P. malariae (Plasmodium pan-specific pLDH) và cuối cùng là kháng nguyên loại Aldolase.
Nhìn chung, các test RDTs có độ nhạy và độ đặc hiệu cũng như độ chính xác rất cao, xấp xỉ 100% khi phát hiện P. falciparum ở mật ðộ > 100 KST/µL máu ngoại vi hoặc > 0.002% tổng số hồng cầu nhiễm. Ða số kết quả âm tính giả xảy ra khi KSTSR ở mật độ KST quá thấp. Tuy nhiên, theo một số báo cáo, kết quả âm tính giả cũng xảy ra ở mật độ KST quá cao. Điều này được giải thích một phần là do tính đa dạng về di truyền kháng nguyên của Pf HRP-2 hoặc một phần là do có thể hiện tượng “prozone” can thiệp vào.
Vậy hiện tượng “prozone” là gì? Đây là hiện tượng kết quả âm tính hoặc dương tính yếu của phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể (KN-KT), do có nồng độ KN hoặc KT cao đã ức chế phản ứng hình thành kháng nguyên kháng thể (điều này cũng đã có liên quan đến một số phản ứng miễn dịch trong bệnh lý khác như sán lá gan, viêm gan siêu vi B, viêm gan siêu vi C). Trong một vài báo cáo gần đây đăng tải, các nhà khoa học đã đề cập đến hiện tượng “prozone” ở các RDTs khi mẫu máu có mật độ KSTSR P. falciparum cao nhưng khi pha loãng mẫu máu này thì kết quả lại chính xác, không còn thấy kết quả âm tính giả nữa.
Một một nghiên cứu hồi cứu có phân tích về hiện tượng “prozone” trong khi thực hiện các test chẩn đoán nhanh (RDTS) trong phát hiện và chẩn đoán sốt rét P. falciparum tại một bệnh viện của tỉnh Tete (Mozambique)là một vùng sốt rét lưu hành (SRLH) từ tháng 2 đến 4/2010).
Trong nghiên cứu này mỗi RDTs được đánh giá ở các mẫu máu nhiễm P. falciparum (mật độ ≥ 4% hồng cầu) và cũng ở các mẫu máu này nhưng được pha loãng 10 lần bằng nước muối sinh lý. Hiện tượng “prozone” được xem là có xảy ra khi RDTs cho kết quả không vạch dương, vạch mờ, vạch nhạt với mẫu máu không pha và pha loãng và cho kết quả vạch có đậm độ màu ở các mức độ đậm nhạt khác nhau (ít nhất là 1 bậc) với mẫu máu bệnh phẩm này khi pha loãng 10 lần bằng nước muối sinh lý (qua 2 người kiểm tra độc lập và lặp lại 2 lần). Cường độ vạch ở RDTs được chia làm 5 mức độ:
(i)Không thấy vạch,
(ii)Vạch mờ,
(iii)Vạch nhạt (nhạt hơn vạch đối chứng),
(iv)Vạch đậm trung bình (đậm ngang vạch đối chứng),
(v)Vạch đậm (đậm hơn vạch đối chứng).
Kết quả cho thấy trong số 873 trường hợp nhiễm P. falciparum xác định qua giọt máu dày trên 7.543 người bệnh sốt rét, chọn được 92 ca (10.5%) có mật độ KSTSR cao ≥ 4%. Trong số này có 76 ca được đưa vào để nghiên cứu hiện tượng “prozone” vì có lưu mẫu máu chống đông bằng dung dịch EDTA, kết quả cụ thể như sau:
Bảng 1. Số lượng mẫu máu nhiễm P. falciparum với mật độ KSTSR ≥ 4% có cho hiện tượng “prozone” đối với các RDTs phát hiện loại kháng nguyên HRP-2 (n = 6) và loại kháng nguyên Pf-pLDH (n = 2)
Tên RDT thử nghiệm | Phát hiện kháng nguyên | Số mẫu thử | Số mẫu cho hiện tượng “prozone” (%) | Cường độ màu của vạch khi thử ở máu không pha loãng |
Không | Mờ | Nhạt |
Paracheck-Pf | HRP-2 | 76 | 29 (38,2) | 3 | 5 | 21 |
ICT Malaria | HRP-2 | 76 | 27 (35,5) | 1 | 10 | 16 |
SD Malaria Antigen Pf FK50 | HRP-2 | 76 | 25 (32,9) | - | - | 25 |
Hexagon Malaria Combi | HRP-2 | 72 | 12 (16,7) | - | - | 12 |
SD Malaria Antigen Pf/Pan FK60 | HRP-2 | 76 | 6 (7,9) | - | - | 6 |
Malaria Pan/Pv/Pf Rapid Device | HRP-2 | 75 | 5 (6,7) | - | - | 5 |
SD Malaria pLDH FK40 | Pf-pLDH | 76 | 0 (0,0) | | | |
CareStart Malaria pLDH | Pf-pLDH | 76 | 0 (0,0) | | | |
Kết quả ở nghiên cứu này cho thấy hiện tượng “prozone “ xảy ra rải rác ở mẫu máu có mật độ KSTSR cao và ở các test phát hiện HRP-2, nhưng không thấy ở test phát hiện loại kháng nguyên Pf-pLDH. Kết quả này cũng phù hợp với một vài báo cáo trước đó của Gillet J. đăng trên tạp chí Malaria Journal, 2009,8 :271). Lý do xuất hiện hiện tượng “prozone” ở test phát hiện HRP-2, nhưng không thấy ở test phát hiện Pf-pLDH thì vẫn chưa lý giải thấu đáo.
Hình 1. Mẫu nhiễm P. falciparumở mật độ8,3% (Paracheck-Pf)
| Mẫu máu được đánh giá bởi 2 người: - Chưa pha loãng (P25 A và P25 B),
- Pha loãng 10 lần (P25 ×10A và P25 ×10B)
- Pha loãng 100 lần (P25 ×100A và P25 ×100B)
Kết quả : Toàn bộ các test có vạch đối chứng
-P25 A và P25B: Không vạch
-P25 ×10A và P25 ×10B: Vạch mờ
- P25 ×100A và P25 ×100B: Vạch đậm. |
Nghiên cứu này cho thấy mối liên quan giữa mật ðộ ký sinh trùng với hiện tượng “prozone” khi ký sinh trùng có mật độ ≥ 4% không phải luôn rõ ràng. Giải thích điều này có thể qui cho nhiều yếu tố khác nhau, như là sự ẩn cư của KST ở trong mao mạch, sự thay ðổi về kháng nguyên trong chu kỳ phát triển và sự khác nhau giữa các chủng.
Có 2 test RDTs bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi hiện tượng “prozone” (Paracheck-Pf và ICT Malaria) với kết quả âm và mờ xảy ra ở ít nhất 1,2% mẫu có KSTSR dương tính và 10,9% mẫu có mật độ KSTSR cao trong nghiên cứu này.
Ở tần suất như vậy, nó sẽ ảnh hưởng tới sự chính xác của test chẩn đoán và như vậy giá trị dự đoán dương tính (Positive Predictive Value_PPV) sẽ phụ thuộc vào tỷ lệ sốt được quy kết cho SR và tỷ lệ mẫu có mật độ KSTSR cao: cả 2 yếu tố này liên quan tới mức độ lýu hành SR và sự miễn dịch SR trước đó trong quần thể dân cư.
Tuy nhiên, các tác giả cũng lưu ý rằng một thay đổi nhỏ trong thành phần test chẩn đoán nhanh loại phát hiện kháng nguyên HRP-2 giữa các lô sản xuất có thể ảnh hưởng tới hiện tượng “prozone”. Do đó, nên lưu ý kết quả ở đây chỉ phản ánh ở lô nghiên cứu, không nên ngoại suy tới toàn bộ các test chẩn đoán nhanh trong SR.
Mặc dù không đánh giá ở nghiên cứu này, song một vài yếu tố trong cấu trúc của test chẩn ðoán nhanh có thể giải thích cho sự khác nhau về sự xuất hiện hiện tượng “prozone” vì phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể liên quan tới thời gian, các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển/ mao dẫn phức hợp có thể là nguyên nhân, nhất là kích cỡ các lỗ trên màng nitrocellulose, lượng và độ nhớt của dung dịch đệm.
Ngoài ra, cấu trúc của kháng thể, sự thu hút gắn kết của phức hợp kháng nguyên – kháng thể cũng có thể là một yếu tố. Liên quan tới người dùng, sử dụng nhiều máu có thể làm tăng nguy cơ xảy ra hiện tượng “prozone”, có nghĩa là dẫn đến kết quả âm tính giả.
Các tác giả có ý kiến rằng: là tuy hiện tượng ”prozone” hiếm gặp, nhưng việc hiện tượng này xảy ra trong một số test chẩn đoán nhanh phát hiện kháng nguyên HRP-2 có thể làm giảm độ chính xác của các test này và để tránh với hiện tượng “prozone” thì người sử dụng cần biết các hạn chế của test RDTs, nhất là các chế phẩm có phát hiện kháng nguyên HRP-2. Khi diễn giải kết quả nên lưu ý rằng vạch mờ cũng có nghĩa là dương tính.
Đối với những trường hợp nghi ngờ xảy ra hiện tượng “prozone’, thì nên thử lại với mẫu máu pha loãng 10 lần bằng nước muối sinh lý NaCl 0.9%, hoặc kiểm tra lại lam máu nhuộm giêm sa bằng kính hiển vi và/ hoặc thử lại bằng test phát hiện P.f-pLDH.
Về mặt quản lý, thì cần đánh giá các RDTs về hiện tượng “prozone” trước khi sử dụng nhằm tránh bỏ sót ca bệnh. Việc theo dõi hậu mãi hiện tượng “prozone” ở các test RDTs là cần thiết, cũng như tuỳ thuộc vào sự phân bố của mật độ KSTSR trong quần thể dân cư mà phải lưu ý đến khả năng xảy ra hiện tượng “prozone”, nhằm chọn lựa giữa các test RDTs loại Pf-pLDH hay HRP-2.
Thêm một vấn đề chưa được quan tâm đối với các test RDTs
Một vấn đề nữa cũng rất đáng quan tâm khi sử dụng test RDTs khi dùng chúng để phát hiện hoặc chẩn đoán bệnh sốt rét. Trong điều kiện khu vực nóng ẩm và hanh khô của các tỉnh thành cùng với sự biến đỏi khí hậu toàn cầu như hiện nay, nhiệt độ thường các tháng 4-11 hàng năm có nơi lên đến trên 350C hoặc hơn, nên có thể làm khô dung dịch đệm mau chóng, dẫn đến còn que test nhưng hết dung dịch đệm.
Mặt khác, trong quá trình thao tác đôi khi chúng ta làm đổ, vở và mất đi một lượng lớn dịch đệm nên không đủ dùng cho các que còn lại,…nói chung là các nguyên nhân có thể dẫn đến mất đi hoặc hao hụt một lượng lớn dung dịch đệm.
Các nhân viên y tế cũng đã có nhiều sáng kiến thay thế bằng các dung dịch như nước muối sinh lý, nước máy, nước giềng hoặc dung dịch glucose 5% để làm và kết quả chúng ta có thể nghe học nói…
Đa nhân tố ảnh hưởng lên kết quả của test RDTs
· !important; Loại ký sinh trùng & Mật độ ký sinh trùng;
· !important; Loại test thử nghiệm trên thị trường;
· !important; Loại kháng nguyên đích (target Ag)và kháng thể bắt cặp cài đặt (capture Ab);
· !important; Trình diện Ag đích trên KSTSR & sự có mặt của một số isomers;
· !important; Xuất hiện giao bào trong máu, đặc biệt giao bào trưởng thành;
· !important; Sự ẩn cư của KSTSR trong vi huyết quản sâu;
· !important; Tồn tại các kháng nguyên trong máu;
· !important; Sự khác nhau về mặt chất lượng các mẻ và lô (batch / log) sinh phẩm;
· !important; Hiện tượng “prozone”;
· !important; Tiến trình điều trị thuốc trước đó (kháng sinh / thuốc sốt rét);
· !important; Phiên giải kết quả giữa các nhân viên & du khách nếu họ chọn bộ tự chẩn đoán và tự điều trị sốt rét khi đi du lịch đến các vùng sốt rét lưu hành.
· !important; Phản ứng dương tính giả / chéo với các loài KSTSR khác;
· !important; Dương tính giả với các tự kháng thể (autoantibodies):
Dương tính giả với bệnh nhân có yếu tố thấp (Rheumatoid factor)RF);
Dương tính giả cao hơn ở loại test có dùng PfHRP2 với loại IgG (16.5%);
Dương tính giả cao với loại test PfHRP2 dùng IgM (6.6%);
Dương tính giả với loại pLDH test (3.3%);
Chưa thấy xảy ra phản ứng chéo của kháng thể PMA với yếu tố thấp (RF).
· !important; Độ nhạy và độ đặc hiệu có liên quan đến mật độ KSTSR:
Mật độ KSTSR > 100 / µL máu: Se > 90%;
Mật độ KSTSR < 100/ µL máu: Se thay đổi 78- 95%;
Đối với loại test PfHRP2/PMA thì độ nhạy phát hiện đối với P. v thấp hơn;
Đối với loại test pLDH thì độ nhạy có thể ≥ so với P. falciparum.
Dương tính giả và âm tính giả của test
· !important; Dương tính giả:
Dương tính PfHRP2, gồm tồn tại KSTSR vô tính trong máu còn sống và tồn tại dưới ngưỡng phát hiện của KHV;
Tồn tại kháng nguyên do ẩn cư của KSTSR và điều trị không hoàn tất, nên quá trình làm sạch kháng nguyên trong tuần hoàn máu bị trì hoãn;
Phản ứng chéo với các kháng nguyên non-falciparum hoặc yếu tố thấp;
Tỷ lệ (+) tồn tại có liên quan đến độ nhạy của test, loại test, MĐKSTSR trong máu;
Có thể do loại kháng thể bắt cặp.
· !important; Âm tính giả:
Âm tính giả của test đã được báo cáo ngay cả trường hợp SRAT với mật độ KSTSR > 40.000 KST/µl;
Do tính đa dạng hoặc tính không đồng nhất về mặt di truyền của trình diện PfHRP2, sự đứt đoạn của HRP-2 gene;
Hiện tượng “prozone” ở mật độ KSTSR cao trong máu;
Một số trường hợp không giải thích được!
Tài liêu tham khảo
1. !important; Huỳnh Hồng Quang (2007). Chẩn đoán bệnh sốt rét từ chuẩn vàng giêm sa đến sinh học phân tử. http://www/impe-qn.org.vn
2. !important; Huỳnh Hồng Quang (2011). Hiểu biết về các loại kháng nguyên và kháng thể khi sử dụng test chẩn đoán nhanh trong sốt rét. http://www.impe-qn.org.vn
3. !important; Huỳnh Hồng Quang (2012). Bài giảng Carestart Malaria pLDH/HRP2 Combo test và giá trị trong chẩn đoán bệnh sốt rét.
4. !important; Hiện tượng “Prozone” trong các test chẩn đoán nhanh sốt rét. Viện Sốt rét KST-CT thành phố Hồ Chí Minh (2011)
5. !important; Prozone in malaria rapid diagnostics tests: how many cases are missed? Philippe Gillet et al. Malaria Journal 2011;10:166 doi:10.1186/1475-2875-10-166.
6. !important; Gillet , Mori M, Van Esbroeck M, Van den Ende J , Jacobs (2009). Assessment of the prozone effect in malaria rapid diagnostic tests J Malaria Journal, 2009,8 :271.