1. Đặt vấn đề:
Anopheles minimus Theobald là véc tơ truyền sốt rét quan trọng ở khu vực nhiệt đới Châu Á (Reid, 1968)[11]. Nghiên cứucủa Harrison (1980) cho thấy có sự thay đổi về hình thái trong phạm vi loài vàgiữa các loài trong series Myzomyia, sẽ có sự nhầm lẫn từ 5- 10% khi định loại series này ở dạng trưởng thành [7].
Green và cộng sự, 1990 đã chứng minh An. minimus là một nhóm loài đồng hình, khác nhau về hệ enzyme EST và ODH [9]. Các nghiên cứu về đáp ứng của An. minimus với hoáchất phun tồn lưu trong nhà có kết quả khác nhau ở các vùng địa lýkhác nhau. Hơn nữa, An. minimus dường như đã thay đổi tập tính từ đốt máu người trong nhà sang sống ngoài nhà vàđốt máu gia súc (Harrison,1980){7}. Khi nghiên cứu hệ isozyme của các quần thể An.minimus ở Việt Namtác giả Trịnh Đình Đạt và cộng sự,1992 kết luận An. minimus ở Việt Nam có thể gồm 2 loài A và C trên cơ sở phân tích các kiểu hình thái cánh dựa trên sự có hay không gián đoạn trắng gốc costa [2] và các loài này rất khác nhau về sinh thái (Trần Đức Hinh và cộng sự )[4]
Nhiều nghiên cứu trên thế giới xác định An. dirus là một phức hợploài rất đa dạng về kiểu hình và kiểu nhân[13].C.A. Green sử dụng phương pháp điện di isozyme đã xác định được bốn loài A, B, C, D trong phức hợp An. dirus tại Thái Lan[8]. Tại Việt Nam cũng đã xác định An. takasagoensis là loài chị em của An. dirus. An. dirus là vectơ truyền sốt rét vùng rừng núi từ Thanh Hoá trở vào Nam, còn vai trò dịch tể của An. takasagoensis chưaxác định được (Trần Đức Hinh và cộng sự )[3]. Vấn đề sự đa dạng về hình thái, di truyền, sinh lý, sinh thái của 2 phức hợp loàiAn. minimusvà An. dirus vẫn còn nhiều điều cần bàn luận. Chúng tôi tiến hành đề tài“Nghiên cứu hệ isozyme của 2 phức hợp Anopheles minimus và Anopheles dirus ở khu vực Miền Trung-Tây Nguyên” nhằm mục đích: xác định tính đa hình của hệ isozyme của 2 phức hợp An. minimus và An. dirus tại khu vực Miền Trung và Tây Nguyên để góp phần vào việc xác định thành phần loài cácvec tơ truyền sốtrét là điều kiện tiên quyết trongcông tác giám sát vec tơ trong khu vực .
2. Thời gian, địa điểm và phương pháp nghiên cứu:
2.1. Thời gian: nghiên cứu được tiến hành từ tháng 3/2002 đến tháng 3/2004
2.2. Địa điểm: tại một số điểm có các đối tượng nghiên cứu với mật độ cao, sự đa dạng về hình thái và sinh thái và có tình hình dịch tễ sốt rét phức tạp như :
Xã Bình Thạnh (huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận).
Xã Mỹ Thạnh (huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận).
Xã Canh Thuận (huyện Vân Canh, tỉnh Bình Định).
Xã Trà Tập (huyện Trà Mi, tỉnh Quảng Nam).
Xã Iako (huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu thập mẫu: Theo phương pháp WHO (1975) gồm bẩy đèn trong nhà, bẩy đèn ngoài nhà , mồi người trong nhà , mồi người ngoài nhà(từ 6 giờ tối đến 6 giờ sáng ) soi trong nhà ngày (từ 6 giờ sáng đến 10 giờ sáng ), soi chuồng gia súc(từ 7 giờ tối đến 10 giờ tối). Muỗiđược định loại theo bảng định loại muỗi 1987 của Viện Sốt Rét Ký Sinh Trùng Hà Nội. Những con muỗi sống được giữ trong bình nitơ lỏng để chạy điện di . Một số muỗi no máu được đưa về nuôi tại labo đến thế hệ F1 để chạy điện di và phân tích hình thể .
Phương pháp điện di: Mẫu được chạy điện di trên gel polyacrylamid 7,5%, hệ đệm T.E.B. pH = 8,5 theo phương pháp C.A. Green,1990; Nhuộm gel theo phương pháp của C.A. Green ,1990.
Các hệ enzyme nghiên cứu là: Octanol dehydrogenaza (ODH, E.C:1.1.1.73);Esterase (E.C: 3.1.1.1)
Dung dịch nghiền mẫu: Nước cất (100ml), Succore (10 g), Triton X-100 (0,5 ml)
Dung dịch đệm T.E.B: EDTA (10g), Boric acid (31g), Tris-base (100g), Nước cất(500 ml)
Dung dịch đúc gelpolyacrylamid 7,5%, hệ đệm T.E.B. pH = 8,5
Hoá chất | Số lượng cho 2 bản gel 200x200 x1mm |
Acrylamide | 5,7g |
Bis- acrylamide | 0,17g |
Sacharose | 1,9g |
Nước cất | 63,2 ml |
E.B.T stock | 1,9 ml |
Amonium persulfat | 0,06g |
Photo Flo | 0,4ml |
Temed | 0,06ml |
Dung dịch nhuộm ODH: a-napthyl acetate (3mg), b - napthyl acetate (6mg),Fast garnet GBC salt (12,5 mg), Acetol (1ml), EST buffer (40ml) đặt vào tủ ấm 37°C trong 30 phút
Dung dịch nhuộm EST: NAD (7,5mg), NBT (7,5 mg), Tris HCl 1M, pH = 8,5 (5 ml), Nước cất (35 ml), Octanol (0,5ml); Khuấy dung dịch, đặt vào tủ ấm 37°Ctrong 30 phút. PMS (3 mg).
Sử dụng hệ thống điện di đứng, khay điện di đặt ở nhiệt độ 5°C, 30 phút đầu sử dụng cường độ 20mA hiệu điện thế 400V, 3 giờ 30 phút sau cường độ 75mA, hiệu điện thế 300 V.
3. Kết quả:
 | Hình 1 Ảnh điện di Odh 1- 4An. dirus Vân Canh 5-8An. dirusHàm Thuận Nam 8 -13An. dirus Sông Hinh |
 | Hình2 Ảnh điện di Est 1- 4An. dirus Vân Canh 5- 7 An. dirus Hàm Thuận Nam 8 -10An. dirusTrà Mi 11 -13An. dirusChư Sê |
 | Hình3 1- 9An.minimusTrà Mi 9 -13An.minimus Vân Canh |
 | Hình4
Ảnh điện di Est
1- 8 : An. minimusA Vân Canh
9-13 : An. minimus CVân Canh |
 | Hình 5 Ảnh điện di Est 1-8An. minimus A Vân Canh 9-13An. minimus A Tuy Phong |
 | Hình 6 Ảnh điện di Est 1-7An. minimusA TuyPhong 8 -14An. minimusATrà Mi |
 | Hình 7 Ảnh điện di Est 1-8An.varunaTuy Phong 9-13 An. minimus A Tuy Phong |
Bảng 1: Tần số alencủa enzyme ODH của 5 quần thể An. dirus khu vực MT-TN
Locut | Dạng alen | HàmThuận Nam-B.Thuận | Sông Hinh Phú Yên | IaKo Gia Lai | Vân Canh B.Định | Trà Mi Q.Nam |
Odh | N | 35 | 18 | 47 | 92 | 76 |
| 100 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Ho | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| He | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Bảng 2:Tần số alencủa enzyme EST-Icủa 5 quần thể An. dirus khu vực MT-TN
Locut | Dạng alen | H.T. Nam (B.Thuận) | Sông Hinh (Phú Yên) | IaKo (Gia Lai) | Vân Canh (B.Định) | Trà Mi (Q.Nam) |
Est- I | N | 32 | 13 | 47 | 85 | 36 |
| 104 | 0,111 | 0,056 | 0,102 | 0,092 | 0,139 |
| 100 | 0,889 | 0,944 | 0,897 | 0,908 | 0,860 |
| Ho | 7 | 1 | 8 | 17 | 11 |
| He | 8,9 | 1,9 | 7,1 | 18,2 | 10,3 |
Bảng 3 :Tần số alencủa enzyme ODH của 5 quần thể An. minimus khu vực MT-TN
Kiểu cánh | Dạng alen | H.T. Nam (B.Thuận) | Tuy Phong (B. Thuận) | IaKo (G. Lai) | Vân Canh (B.Định) | Trà Mi (Q.Nam) |
A | N | 32 | 108 | 47 | 53 | 155 |
| 114 | 0,031 | 0,046 | 0,064 | 0,094 | 0,052 |
| 100 | 0,969 | 0,954 | 0,936 | 0,849 | 0,935 |
| 80 | 0 | 0 | 0 | 0,057 | 0.013 |
| Ho | 2 | 8 | 6 | 13 | 18 |
| He | 1,9 | 9,5 | 5,6 | 14,3 | 18,6 |
B | N | 8 | 0 | 0 | 0 | 47 |
| 114 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,042 |
| 100 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0,958 |
| 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ho | 4 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| He | 3 | 0 | 0 | 0 | 3.8 |
C | N | 0 | 0 | 0 | 96 | 0 |
| 114 | 0 | 0 | 0 | 0,156 | 0 |
| 100 | 0 | 0 | 0 | 0,844 | 0 |
| 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ho | 0 | 0 | 0 | 25 | 0 |
| He | 0 | 0 | 0 | 25,3 | 0 |
Bảng 4 :Tần số alencủa enzyme EST-I của 5 quần thể An. minimuskhu vực MT-TN
Dạng cánh | Dạng alen | H.T. Nam (B.Thuận) | Tuy Phong (B. Thuận) | IaKo (Gia Lai) | Vân Canh (B.Định) | Trà Mi (Q.Nam) |
A | N | 25 | 75 | 43 | 56 | 77 |
| 100 | 25 | 0 | 0,954 | 0,857 | 0,156 |
| 98 | 0 | 0,040 | 0.046 | 0,143 | 0,844 |
| 92 | 0 | 0,960 | 0 | 0 | 0 |
| Ho | | 6 | 4 | 14 | 20 |
| He | | 5,76 | 3,77 | 13,73 | 20,28 |
B | N | 0 | 0 | 0 | 0 | 41 |
| 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.341 |
| 98 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.658 |
| 92 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ho | | | | | 19 |
| He | | | | | 18,40 |
C | N | 0 | 0 | 0 | 59 | 0 |
| 100 | 0 | 0 | 0 | 0,678 | 0 |
| 98 | 0 | 0 | 0 | 0,322 | 0 |
| 92 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ho | | | | 24 | |
| He | | | | 25,76 | |
3.1. Kết quả điện di enzym Odh và Estcủa Anopheles dirus
Locut Odh là locus mã hoá cho quá trình sinh tổng hợp octanol dehydrogenaze Iocut Est là locus mã hoá cho quá trình sinh tổng hợpesterase. Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy hailocut nàylà chuẩn mực để phân tích isozym [1,2,4, 8, 9,10,11,12}.
Kết quả điện di 268mẫu An. dirus thu được tại 5 điểm nghiên cứu xác định được locut Odh của An. dirus là đơn hình, chỉ có một alen Odh 100 . (Hình 1, Bảng 1)
Phân tích 213 mẫu An. dirus điện di Estcho thấyisozymEst do 3 locut Est -I , Est - II, Est - III xác định. Đối với locut Est -I , có 2 alen là Est 100 và Est 104, alen Est 100 chiếm đa số có tần số từ 0,830 đến 0,944 (Hình 2, Bảng 2)
3.2. Kết quả điện di enzymOdh và Estcủa Anopheles minimus
Do tính chất đa hình của các quần thể Anopheles minimus nên khi phân tích điện di isozym chúng được phân thành các nhóm A, B, C dựa vào một số đặc điểm trên cánh muỗi, nhằm xác định sự tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen.
-An. minimus A: có gián đoạn gốc cánh tại điểm presector trên gân costa, không có điểm trắng humeral.
-An. minimus B: không có gián đoạn gốc cánh ở cả 2 điểm presector và humeral trên gân costa .
-An. minimus C: có gián đoạn gốc cánh ở cả 2 điểm presector và humeral trên gân costa .
Trong 5 địa phương khảo sát, Vân Canh (Bình Định) và Trà Mi (Quảng Nam) được nghiên cứu kỹ vì các quần thể An. minimus tại các địa phương này có sự đa dạng về hình thái và sinh thái. Kết quả thu thập mẫu cho thấy kiểu hình của An. minimus tại 2 địa phương trong khu vực
Vân Canh | Quảng Nam |
Kiểu cánh A | Kiểu cánh B | Kiểu cánh C | Kiểu cánh A | Kiểu cánh B | Kiểu cánh C |
Số cá thể | Tỉlệ% | Số cá thể | Tỉlệ% | Số cá thể | Tỉlệ% | Số cá thể | Tỉ lệ % | Số cá thể | Tỉlệ% | Số cá thể | Tỉlệ% |
44 | 25,4 | 7 | 4,02 | 122 | 70,5 | 985 | 90,87 | 98 | 9,04 | 1 | 0,09 |
Vân Canh kết quả điều tra tháng 6/2004, Trà Mi kết quả điều tra tháng 8/2004
Phân tích hình ảnh điện di isozym Odhcủa 395 mẫu An. minimus A,47 mẫu Anopheles minimus B, 96 mẫu An. minimus C, xác định đượcisozym Odh là đa hình với các alen Odh114, Odh100, Odh 80 . Các alen này có mặt trong tất cả mẫuđiện di của các kiểu A, B, C với các tần số khác nhau. Odh 100 chiếm ưu thế trong cả 3 dạng cánh A, B, C tại các địa phương khảo sát và nằm trong khoảng 0,844 đến 0,969. Các alen Odh114,Odh 80 có mặt với tần số thấp hơn nằm trong khoảng 0,013 đến 0,156 (Hình 3, Bảng 3)
Điện di Est276 mẫu An. minimus A, 41 mẫu An. minimus B, 59 mẫu An. minimus C, chúng tôi thu được các Locut Est bao gồm Est -I, Est -II , Est -III. Phân tích 276 mẫu có dạng cánh A, tại Vân Canh xác định được locut Est-I, Est 100chiếm ưu thế với tần số alen là 0,875. Tại Trà Mi, Est 98chiếm ưu thế với tần số alen là 0.844. Tại Tuy Phong, Est 92 chiếm ưu thế với tần số alen là 0.960. Đối với dạng cánh B và C các kết quả phân tích locut Est -I cũng tương tự . Như vậy, tần số các alen ưu thế khác nhau theo vùng địa lý mà không khác nhau theo kiểu hìnhA, B, C.(Hình 4,5,6; Bảng 4)
4. Bàn luận:
Trong đề tài này các vec tơ được tập trung phân tích hệ isozym là An. minimus và An. dirus. Một số loài trong phức hợp Anopheles leucosphyrus như An.takasagoensis hay trong nhóm Myzomyia như An. aconitus, An. varuna, An. pampanai … không được xem xét vì hình thái và isozym của các loài này đã được nhiều công trình trước đây nghiên cứu kỹ[1,2,4 ] và việc định danh các loài này hoàn toàn có thể dựa trên hình thái.
Qua kết quả phân tích isozym của 5 quần thể An. dirus cho thấy kiểu gen của locut Odh là đơn hình, kiểu gen của locut Est là đa hình với tần số alen biến thiên thấp, chúng là các biến dị trong loài. Kết quả này cũng đồng nhất với các nghiên cứu của Trần Đức Hinh và Nguyễn Đức Mạnh trước đây.[4]
Trong 5quần thể An. minimus tại khu vực nghiên cứu, An. minimus A, C tại Vân Canh vàAn. minimus A, B Trà Micó sự đa dạng về hình thái cánh vàđiện di enzym, các biến dị của các alen với tần số thấp, sự tồn tại của các dạng dị hợp tửphân bố phù hợp với định luật Hardy - Weinberg cho thấy chúng là một quần thể cân bằng về di truyền. Vì thế về mặt di truyền isozym có thể kết luận trong 5 quần thể được khảo sátchỉ có một loài An. minimus đặc trưng bằng alen Odh 100 .
Kết quả phân tích isozym của Sucharit và cộng sự (1988)[12] cho rằng An. minimus P form (kiểu cánh C ) là một loài mới táchra từ M form ( kiểu cánh A) không phù hợp với một số kết quả nuôi và phân tích hình thái ở thế hệ F1 tại labo Viện Sốt Rét Quy Nhơn ( 2003)
Địa phương | Kiểu cánhP (số cá thể ) | Kiểu cánh F1 (số cá thể )
|
A | B | C | A | B | C |
Vân Canh | 5 | | | 26 | | 10 |
Vân Canh | | | 18 | 59 | | 262 |
Trà Mi | 9 | | | 137 | 14 | |
Trà Mi | | 2 | | 16 | 5 | |
Tại Vân Canh 5 cá thể An. minimus cánh A sinh ra 26 con có kiểu cánh A và 10 concó kiểu cánh C, 18 cá thể An. minimus cánh Csinh ra 59 concó kiểu cánh A và 262 concó kiểu cánh C .
Tại Trà Mi, 9 mẹ An.minimus A có hậu thế137 A và 14 B, 2 mẹ An.minimus B có 16 con mang cánh A và 5 mang cánh B.
Như vậy không có sự tương đồng về kiểu gen và kiểu hình trong trường hợp này, hay nói cách khác các biến dị kiểu cánh A, B, C là các biến dị trong loài .
Chúng tôi thống nhất với C.A. Green và cộng sự (1990)[12] cách phân loại dựa theo hình thái cánh (có hay không các gián đoạn gốc cánh ở cả 2 điểm presector và humeral trên gân costa) sẽ đưa đến một số nhầm lẫn. Nếu có các nghiên cứu toàn diện kết hợp của nhiễm sắc thể, protein, DNA…có thể phát hiện một số loài đồng hình trong phức hợp An. minimus nhưng sự phân biệt các loài này không thể dựa trên hình thái cánh. Các công trình nghiên cứu của tác giả Trịnh Đình Đạt cũng chỉ ra rằng nếu chỉ sử dụng các đặc điểm hình thái cánh để phân loại sẽ không chính xác .
5. Kết luận:
-Kết quả phân tích điện di enzym của 5 quần thể An. minimus và An .dirus tại khu vực Miền Trung và Tây Nguyên cho thấyhệ enzym Odh là đơn hình đối với An dirus và đa hình đối với An. minimus,hệ enzym Est là đa hình đối với An dirus vàAn. minimus.
-Trong 5 quần thể An. minimus khảo sát trong khu vựcchỉ có một loài An. minimus đặc trưng bằng alen Odh 100 .
-Các biến dị điện di enzym Est của An. dirus là các biến dị trong loài.
6. Đề nghị:
Để có một kết luận toàn diện về thành phần loài An. minimus , An. dirus trong khu vực Miền Trung và Tây Nguyên cần nghiên cứu thêm một số địa phương trong khu vực và nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, tế bào, sinh hoá, miễn dịch, sinh học phân tử… đặc biệt là các phép lai giữa các dạng và phân tích di truyền các con lai .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Nguyễn Thị Hương Bình, 1998. Nghiên cứu sự đa hình di truyền một số loài muỗi thuộc series Myzomyia(Diptera: Culicidae) ở một số địa điểm của Việt Nam.
2.Trịnh Đình Đạt, Trương Quang Học, Ngô Giang Liên, Vũ thị Loan, 1992. Nghiên cứu một số hệ isozyme và ứng dụng trong phân loại phức hợp loài Anopheles minimus Theobald1901( Diptera: Culicidae) ở Việt Nam. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng số 2: 1- 4
3.Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Lê Đình Công, Nguyễn Thọ Viễn và ctv 1997. Bổ sung dẫn liệu điều tra về muỗi Anopheles và thực trạng phân bố vec tơ sốt rét ở Việt Namgiai đoạn 1991-1995 . Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng . Nhà xuất bản Y học, tập 1: 287-298
4.Trần Đức Hinh , Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung và ctv,1997. Một số dẫn liệu về tính đa hình di truyền liên quan đến tập tính đốt mồi và trú đậu của An. minimus ở miền Bắc Việt Nam. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng. Nhà xuất bản Y học , tập 1: 299-304
5.Hồ Đình Trung, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Marc Coosemans và ctv,1996. Kết quả bước đầu sử dụng điện di isozyme trên gel cellulose acetate trong nghiên cứu An. minimus ở Việt Nam. Thông tin phòng chống sốt rét và các bệnh ký sinh trùng 4: 40-46
6.Nguyễn Thọ Viễn, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh và ctv,1997. Nghiên cứu muỗi Anopheles (Cellia) minimus Theobald và biện pháp phòng chống chúng ở Việt Nam giai đoạn 1986-1990. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng Nhà xuất bản Y học , tập 1: 127-140.
7.Harrison, B.A. 1980. Medical Entomology Studies – XIII. The Myzomyia series of Anopheles (Cellia) in Thailand, with emphasison intra-interspecific variations( Diptera: Culicidae) Cont. Am. Entomol.Inst17:193
8.Green C.A., L. E. Munstermann, Tan S.G., P. Sakol andBaimai V. 1992 Population genetic evidence for species A, B, C and D of Anopheles dirus complex in Thailand and enzyme electromorphs for their identification Med.Vet.Ent 6:29-36.
9.Green C.A., Gass R.F.,Munstermann L.E.and Baimai V. 1990. Population genetic evidence for two species in Anopheles minimus in Thailand Med.Vet.Ent 4, 25-34
10.Komalamisra N.1989Genetic variability in isozymes of Anopheles minimus group from various localities in Thailand . Jpn. J .Sanit. Zool. Vol.40.No 2 p.69-80,
11.Reid, J.a. (1968)Anopheles mosquitoesof Malaya and Boneo. Studies of the Institude forMedical Research, Malaysia. No 31, 520pp
12.Sucharit S., Komalamisra N., Leemingsawat S., Apiwathnasorn C. and Thongrungkiat S. 1988 Population genetic studies on the Anopheles minimus complex in Thailand . Southeast Asian J. Trop.Med.Pub.Hlth.Vol.19 No. 4 December 1988
13.Sucharit S., Choochote W., Pratchyanusorn N., Limsuwan.S, Apiwathnasorn C. and Kanda T.,1983. Esterase patterns of Anopheles dirus ( Bangkok strain) and Anopheles balabacencis ( Perlis form) in the laboratory. Southeast Asian J. Trop.Med.Pub.Hlth.Vol.14 No. 1 March 1983