Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) có tới 50% muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và giun chỉ trong số 200 loài động vật chân đốt có vai trò y học về kháng hóa chất. Việc xác định tính kháng đối với các véc tơ sốt rét là yêu cầu cấp thiết nhằm nâng cao hiệu quả của công tác phòng chống sốt rét, vì vậy nghiên cứu mức độ kháng hóa chất của nhóm loài Anopheles maculatus ở một số điểm thực địa miền Trung-Tây Nguyên bằng kỹ thuật điện di enzym nhằm xác định mức độ kháng hóa chất của nhóm loài này.
Xác định, đánh giá hiệu quả các loại hóa chất diệt nhằm đánh giá và lựa chọn các loại hóa chất diệt côn trùng phù hợp với từng loại véc tơ sốt rét cũng như tình trạng kháng hóa chất và biện pháp đối phó. Trong những năm gần đây, việc sản xuất các loại hóa chất mới có giảm sút đi vì lý do công nghiệp và giá chi phí đặc biệt khi áp dụng trên phạm vi rộng lớn.
Ở Thái Lan nhóm loài An.maculatus là véc tơ chính truyền bệnh sốt rét,phức hợp loài An. maculatus gồm có 10 loài trong đó người ta đã xác định được có 2 loài trong phức hợp này là: An.maculatus và An.sawadwongporni là vectơ truyền bệnh sốt rét chính. Phức hợp loài An. maculatustại Việt Nam đã xác định06 loài trong phức hợp loài đồng hình và đã xác định có 1 loài trong phức hợp này là: An.sawadwongporni là véc tơ truyền bệnh sốt rét chính.
Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu đánh giá độ nhạy cảm của phức hợp loài muỗi An.maculatus với hóa chất diệt côn trùng dựa trên kỹ thuật thử sinh học và điện di enzym liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng ở muỗi An. maculatus– véc tơ phụ truyền sốt rét ở khu vực trung du miền núi trên toàn quốc là cần thiết nhằm lựa chọn các biện pháp phòng chống thích hợp, tránh lãng phí và gây ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu thực hiện ở các tỉnh Bình Định, Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Trị trong 2 năm 2011-2012.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp điện di protein enzyme
Enzyme Esterase chính là một trong số những enzyme liên quan đến tính kháng thuốc ở côn trùng trong đó carboxylesterase (E.C:3.1.1.1) có liên quan nhiều nhất tới tính kháng thuốc. Hàm lượng của enzyme này càng cao thì tính kháng thuốc càng mạnh. Việc phân tích hệ enzyme được thực hiện trên gel polyacrylamid 7,5% với hệ đệm T.E.B, pH = 8,5. Esterase là một nhóm lớn các enzymecó khả năng là thuỷ phân các liên kết estevới sự có mặt của nước tạo thành acid và alcohol. Chúng thuỷ phân xúc tác cho phản ứng sau:
RCOOR1 + HOH ® RCOOH + R1OH
Esterase là nguyên nhân gây ra tính kháng ở các hóa chất diệt chứa các liên kết este như OP và Car. Trong nhiều trường hợp, các mức độ EST tăng lên bởi sự khuyếch đại gen hoặc các gen bị đột biến hình thành các enzyme EST bị thay đổi về cấu trúc là cơ chế gây ra tính kháng. Các kết quả phân tích hóa sinh, phân tích invitro chuyển hóa các thuốc diệt ở các dòng kháng, nhạy từ các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã cho thấy một số enzyme EST có liên quan trực tiếp đến tính kháng thuốc. Pasteur và Singer (1975-1978) đã phát hiện thấy tính kháng thuốc OP ở loài Culex quinquefasciatus có liên quan đến hoạt tính enzyme EST.
Phương pháp thử nhạy khángở muỗi
Phương pháp của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO),1998 [13]. Mục đích của kỹ thuật này là xác định một loài muỗi nhạy, tăng sức chịu đựng, hoặc kháng với một loại hoá chất. Điều kiện lý tưởng cho thử nghiệmlàmuỗi cái thử nghiệm chưa hút máu, 1-2 ngày tuổi, khoẻ mạnh. Số lượng ít nhất cho một thử nghiệm là 150 cá thể. Nhiệt độ phòng thử nghiệm : 25 ±2°C, độ ẩm tương đối 70 - 80 %.
Đọc kết quả thử nghiệm Sau 24 giờ đọc kết quả thử nghiệm. Những con muỗi còn bay được tính là muỗi sống.
Ở lô đối chứng
-Tỉ lệ muỗi chết> 20% :Kết quả thử nghiệm không được chấp nhận. Làm lại thử nghiệm.
-Tỉ lệ muỗi chết5 - 20 %: Kết quả thử nghiệm phải được điều chỉnh lại theo công thức Abbott.
-Tỉ lệ muỗi chết< 5% : Kết quả thử nghiệm được chấp nhận.
Ở lô thử nghiệm
-Tỉ lệ muỗi chếttừ98- 100%: Muỗi nhạy với hoá chất thử nghiệm.
-Tỉ lệ muỗi chết từ 80 - 97 %: Muỗi tăng sức chịu đựng với hoá chất thử nghiệm.
-Tỉ lệ muỗi chết< 80%: Muỗi kháng với hoá chất thử nghiệm.
Kết quả nghiên cứu
Kết quả thử Bioassay
Anopheles maculatus được thu thập và thử nghiệm bioassay với Alpha-cypermethrine và Lambda-cyhalothrine tại các điểm nghiên cứu.
Kết quả thử nhạy cảm Anopheles maculatus tại Bình Định.
Kết quả thử nhạy cảm Anopheles maculatus với Alpha- cypermethrine 30mg/m2 và Lambda cyhalothrine 0,05%
Hóa chất thử nghiệm | Số lượng thử nghiệm | Số lượng muỗi ngã gục | Số lượng muỗi chết sau 24 giờ |
10 phút | 30 phút | 60 phút |
Alpha- cypermethrine 30mg/m2 | 100 | 21 | 70 | 100 | 92 |
Lambda- cyhalothrine 0,05% | 100 | 19 | 65 | 100 | 73 |
Kết quả thử nhạy cảm An. maculatus với giấy thửAlpha-cypermethrine 30mg/m2, số lượng muỗi thử nghiệm là 100 cá thể, kết quả có 92 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 92%.Như vậyAn. maculatus tại Bình Định tăng sức chịu đựngvới hóa chấtAlpha- cypermethrine.
Kết quả thử nhạy cảm An. maculatus với giấy thửLambda-cyhalothrine 0,05%, số lượng muỗi thử nghiệm là 100 cá thể, kết quả có 73 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 73%.Như vậyAn.maculatus tại Bình Định đã khángvới hóa chấtLambda- cyhalothrine.
Kết quả thử nhạy cảm Anopheles maculatus tại Đắc Lắc.
Kết quả thử nhạy cảm Anopheles maculatus với Alpha- cypermethrine 30mg/m2 và Lambda cyhalothrine 0,05%
Hóa chất thử nghiệm | Số lượng thử nghiệm | Số lượng muỗi ngã gục | Số muỗi lượng chết sau 24 giờ |
10 phút | 30 phút | 60 phút |
Alpha- cypermethrine 30mg/m2 | 100 | 17 | 76 | 100 | 79 |
Lambda- cyhalothrine 0,05% | 100 | 16 | 66 | 100 | 75 |
Kết quả thử nhạy cảm đối với loài Anophelesmaculatusvới giấy thửAlpha- cypermethrine 30mg/m2, số lượng muỗi thử nghiệm là 103 cá thể, kết quả có 79 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 79%.Như vậyAnophelesmaculatus tại Đắc Lắc đã khángvới hóa chấtAlpha- cypermethrine .
Thử nhạy kháng An.maculatusvới giấy thửLambda- cyhalothrine nồng độ 0,05%, số lượng muỗi thử nghiệm là 100 cá thể, kết quả có 81 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 75%. Như vậyAn. maculatus Đắc Lắc đã khángvới hóa chất Lambdacyhalothrine.
Kết quả thử nhạy cảm Anopheles maculatus tại Phú Yên.
Kết quả thử nhạy cảm của Anopheles maculatus với hoá chấtAlpha- cypermethrine 30mg/m2 và Lambda cyhalothrine, nồng độ 0,05%
Hóa chất thử nghiệm | Số lượng thử nghiệm | Số lượng muỗi ngã gục | Số lượng muỗi chết sau 24 giờ |
10 phút | 30 phút | 60 phút |
Alpha-cypermethrine 30mg/m2 | 100 | 15 | 67 | 100 | 76 |
Lambda-cyhalothrine 0,05% | 100 | 16 | 72 | 100 | 87 |
Thử nhạy kháng An.maculatusvới giấy thửAlpha- cypermethrine 30mg/m2, số lượng muỗi thử nghiệm là 100 cá thể, kết quả có 76 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 76%.Như vậyAn. maculatus tại Phú Yên đã khángvới hóa chấtAlpha- cypermethrine .
Thử nhạy kháng An. maculatusvới giấy thửLambda- cyhalothrine Nồng độ 0,05%, số lượng muỗi thử nghiệm là 108 cá thể, kết quả có 87 cá thể muỗichết 24 giờ sau khi tiếp xúc với hóa chất. Tỉ lệ muỗi chết ở lô thửnghiệm là 87%.Như vậyAn. maculatus tại Phú Yên tăng sức chịu đựngvới hóa chấtLambdacyhalothrine.
Kết quả thử nhạy cảm của loài Anopheles maculatus tại Quảng Trị.
Kết quả thử nhạy cảm của Anopheles maculatus với hoá chấtAlpha- cypermethrine 30mg/m2 và Lambda cyhalothrine, nồng độ 0,05%
Hóa chất thử nghiệm | Số lượng thử nghiệm | Số lượng muỗi ngã gục | Số lượng muỗi chết sau 24 giờ |
10 phút | 30 phút | 60 phút |
Alpha-cypermethrine 30mg/m2 | 100 | 24 | 80 | 102 | 84 |
Lambda- cyhalothrine 0,05% | 100 | 18 | 63 | 100 | 78 |
Tỷ lệ % muỗi chết tại Quảng Trị là: 84%, như vậy loài An.maculatus đã tăng sức chịu đựng với Alphacypermethrin 30mg/m2.
Tỷ lệ muỗi chết là 78% như vậy loài An. maculatus đã kháng với hóa chất Lambda cyhalothrine, nồng độ 0,05% tại Quảng Trị.
Kết quả điện di enzyme esterase.
Kết quả điện di loài An. dirus đối chứng
Trong hình sau, ta phân tích nhóm băng chạy nhanh nhất thể hiện là màu nhạt hơn, chứng tỏ hoạt động enzym yếu. Kết quả này trùng hợp với kết quả của các phép thử sinh học (100% An. dirus nhạy).  |
| Hình 1: Kết quả điện di enzyme esterase An. dirus tại labo |
Kết quả điện di loài An. maculatus
Qua 4 hình trên có thể khẳng định rằng enzyme esterase là một chỉ thị tốt cho tính kháng pyrethroid ở muỗi đặc biệt là nhóm băng Est-1. Bởi vì enzyme esterase có vai trò quan trọng trong việc giải độc và gây nên tính kháng, hàm lượng esterase cao, nên độ bắt màu tùy thuộc vào mức độ kháng hóa chất của từng loài. Có rất nhiều nghiên cứu trên côn trùng đã phát hiện sự bắt màu của các cấu tử điện di có quan hệ chặt chẽ với độ nhạy cảm của chúng với các thuốc diệt. Qua kết quả điện di enzyme esterase loài An.maculatus có thể nhận thấy vùng hoạt động của Est-1,2 là rất rõ nét, hầu hết các cá thể muỗi bắt màu đậm. Như vậy sự hoạt động mạnh của esterase là rất cao điều này cũng phù hợp với kết quả thử sinh học của loài này.
 |  |
Hình 2 Kết quả điện di enzyme esterase
An. maculatus tại Đắc Lắc | Hình 3 Kết quả điện di enzyme esterase An. maculatus tại Phú Yên |
 |  |
Hình 4: Kết quả điện di enzyme esterase An. maculatus
tại Bình Định | Hình 5: Kết quả điện di enzyme An. maculatus
tại Quảng Trị |
Bàn luận
Việc xây dựng chiến lược phòngchống véc tơ căn cứ vào phản ứng của véc tơ với hoá chất ở địa phương. Ở Việt Nam, từ năm 1990 các hoá chất thuộc nhóm pyrethroid như: permethrine (Imperator), Lambda- cyhalothrine (Icon), deltamethrine (K’Othrine), Alpha- cypermethrine (Fendona )…được đưa vào sử dụng để phòng chống muỗi sốt rét. Hằng năm, thử nghiệm nhạy kháng được tiến hành thường xuyên để đánh giá phảnứngcủa muỗi với hoá chất. Theo công trình nghiên cứu của Trương Văn Có (2005)[3]: Giai đoạn1996-1998, các thử nghiệm ở khu vực Miền Trung - Tây Nguyên xác định An. minimus nhạy với tất cả các loại hoá chất trong nhóm pyrethroid, trong khi đó An. vagus, An. barbirostris và An. sinensis kháng với permethrin. Giai đoạn 1999-2003, danh sách muỗi Anopheles kháng vớipermethrinetăng thêm2 loài An. philippinensis và An. maculatus. Đến năm 2004, nhiều loài Anophelescó hiện tượng tăng sức chịu đựng hay kháng đối với các hoá chất này, tuy nhiên 2 véc tơchính là An. minimus và An. dirus chỉ tăng sức chịu đựng ở một số địa phương. Phảnứng của muỗi đối với hoá chất không những phụ thuộc vào bản chất di truyền của muỗimà còn phụ thuộc vào tình hình sử dụng hoá chất ở địa phương. Ở vùng rừng núi, nơi người dân không có tập quán sử dụng hoá chất cho cây trồng, các loại côn trùng rất nhạy đối với hoá chất thử nghiệm. Tuy nhiên trong vòng mấy năm trở lại đây do việc lạm dụng hoá chất trong nông nghiệp, đã làm các loài côn trùng trong đó có muỗi Anopheles kháng với hoá chất. An. minimustăng sức chịu đựng với Alpha- cypermethrine , Lambda- cyhalothrine là điều đáng quan tâm trong công tác phòng chống sốt rét tại Bình Định và một số địa phương khác vì thế cần có một biện pháp phòng chống véc tơ bổ sung hay thay thếđể duy trìbền vững các thành quảbảo vệ sức khoẻ cho nhân dân mà ngành y tế địa phương đã xây dựng được trong mười mấy năm qua.
Theo tác giả Trịnh Đình Đạt và cộng sự khi phân tích hệ izozym esterase của ba loài muỗi truyền bệnh sốt rét cho thấy hệ izozym esterase của ba loài này mang tính đa hình rõ rệt. Theo nhiều tác giả tần số alen cao và có băng đậm màu biểu hiện tính kháng cao với thuốc diệt.
Kết luận
Qua kết quả nghiên cứu về tính kháng của muỗi chúng tôi có thể đưa ra một số kết luận sau :
1. Quần thể An. maculatus đã khángvà tăng sức chịu đựng cao với 2 loại hóa chất đang sử dụng trong chương trình phòng chống sốt rét quốc gia là alpha-cypermethrine và lambda-cyhalothrine tại các điểm nghiên cứu.
2. Enzyme esterase có thể sử dụng như một chỉ thị bước đầu đánh giá về mức độ nhạy và khángcủa các loài Anopheles.
Đề nghị
1.Đã xuất hiện quần thể An.maculatus kháng với hóa chất nhóm pyrethroid vì vậy cần nghiên cứu các chế phẩm mới có hiệu lực trong phòng chống véc tơ.
2. Việc tạo dòng muỗi nhạy và kháng trong phòng thí nghiệm là cần thiết cho việc xác định mức độ kháng đối với từng nhóm hoá chất diệt côn trùng.
3. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để xác định cơ chế kháng của các loài Anopheles từ đó có thể đưa ra những thuốc diệt có hiệu quả lâu dài trong phòng chống sốt rét.
Tài liệu tham khảo
1.Nguyễn Thị Hương Bình (2009), Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles maculatus tại Việt Nam. Luận án Tiến Sỹ Sinh Học, trường Đại học Khoa học Tựnhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Trương Văn Có (2005), “Thực trạng nhạy kháng của Anopheles với hoá chất diệt ,hiệu lực tồn lưu trên màn tẩm và tường vách ở khu vực Miền Trung - Tây nguyên”, Tạp chí Y học Thực hành, Bộ Y Tế xuất bản, số 511: tr 116-121
3.Nguyễn Thị Duyên (2009), Nghiên cứu quần thể Anopheles minimus tại xã Bình Thạnh, Huyện Tuy Phong, Tỉnh Bình Thuận. Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
4.Trịnh Đình Đạt, Trương Quang Học, Ngô Giang Liên (1991), “Nghiên cứu một số hệ isozym ở nhóm loài muỗi sốt rét Anopheles minimus, Theobal, 1901 (diptera culicidae) ở Việt Nam”, Hội nghị côn trùng học quốc gia Việt Nam lần thứ nhất, Hà Nội, tr. 47.
5.Nguyễn Thị Thu Hoài (2003), Nghiên cứu sự biểu hiện izozym ở các quần thể muỗi Aedes aegypti tại một số vùng của Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp hệ đào tạo cử nhân tài năng trường Đại học Khoa học Tựnhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
6.Lương Thị Liên (2002), Nghiên cứu tính kháng thuốc trừ sâu và hiện tượng đa hình enzym Esterase của ba quần thể sâu tơ ở ngoại thành Hải Phòng, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
7.Đào Minh Trang (2008), Nghiên cứu hoạt tính một số enzym liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng ở muỗi Anopheles minimus phân bố tạimiền Bắc Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tựnhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
8.Brogdon WG., (1989), “Biochemical resistance detection: an alternative to bioassay”, Parasitology Today, 5, pp.56-60.
9.James A. Ferrary, (1996), ‘’Insecticide resistance’’ The Biology of Disease Vectors, pp. 512-516.
10.Hemingway Janet and Hilary Ranson, (2000), “Insecticide resistance in Insec Vectors of Human Disease”, Annu.Rev.Entomol., 45, pp.371-391.
11.Lien JC, (1991), “Anopheline mosquitoes and parasites in Taiwan”. Kaohsiung Journal of Medical Sciences, 7, pp. 207-223.
12.WHO, (1993), A global strategy for malaria control, Geneva.
13.WHO, (1998), Techniques to detect insecticide resistance mechanism, WHO/CDS/CPC/MAL/98.6.
14.WHO, (1998), Test procedure for insecticide resistance monitoring in malaria vectors, bio-efficacy and persistence of insecticide on treated surfaces, WHO/CDS/CPC/MAL/98.12.