Muỗi Anopheles dirus nuôi trong labo khoa Côn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn sau nhiều năm bắt đầu có hiện tượng thoái hóa giống, biểu hiện giảm số lượng trứng đẻ, tỉ lệ trứng nở, tỉ lệ bọ gậy lột xác…Thu thập muỗi An. dirus ngoài thực địa về thuần chủng, lai tạo cải thiện giống hiện có là cần thiết nhằm duy trì véc tơ này trong phòng thí nghiệm phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu nhằm đạt mục tiêu thuần chủng muỗi An. dirus thực địa trong labo, xác định một số đặc điểm sinh học và, xác định các yếu tố môi trường phù hợp để giữ chủng An. dirus trong labo.
Đặc điểmhình thái An. dirus
Bọ gậy: Lông ăng ten đơn, lông môi đơn, tấm kitin trước đốt bụng từ IV-VII nhỏ.Ba cụm lông bờ ngực hoàn toàn đơn, lông vai trong phân trên 10 nhánh, gốc lông vai trong và lông vai giữa có mấu kitin nhọn, không chung gốc.
Quăng: Phễu thở nằm dọc theo thân, không có rãnh thứ 2, bờ phễu thở đơn giản. Miệng phễu thở hẹp, không tròn, lông bánh lái thường ngắn và thẳng, gai bên đốt bụng V dài hơn¼ chiều dài đốt , răng bánh lái thô cứng, lông số 1 các đốtbụng từ V-VII thường kép
Muỗi : Đầu (vòi đen, đầu mút vòi có 1 đốm màu vàng rơm, pan có 4 băng trắng, băng trắng thứ nhất dài gấp 2-3 lần băng trắng 2,3,4; các băng trắng 2,3,4 tương đối bằng nhau); Cánh (gân costa có trên 4 điểm đen, gốc costa gián đoạn, điển đen presector trên gân L1 kéo dài về phía gốc cánh hơn điểm đen tương ứng trên gân costa);chân (chân hoa, ở khớp cẳng bàn có băng trắng rộng).
 |
Phòngnuôi bọ gậy tại Viện |
Kỹ thuật nuôi Anopheles
Phòng nuôi bọ gậy:
Đặt ở vị trí thoáng, thông gió, có nhiều giá bằng nhôm để đặt khay nuôi bọ gậy, có máyđiều hòa nhiệt độ giữ nhiệt độ trong phòng theo yêu cầu nghiên cứu.
Phòng nuôi muỗi:
Được trang bị bằng lưới nhôm với kích thước ô rất nhỏ không cho muỗi bay qua, cửa ra vào2 lớp không cho muỗi thoát ra ngoài, có máyđiều hòa nhiệt độ giữ nhiệt độ trong phòng theo yêu cầu nghiên cứu, có nhiệt độ, ẩm độ tự ghi để theo dõi nhiệt, ẩm độ trong phòng, có giá để lồng muỗi cao 1,2m, chân giá được bảo vệ chống kiến.
Kính lúp có các độ phóng đại 10x, 20x,50x; Máy đo pH nước; Lồng nuôi muỗi bằng có khung nhômbao lưới nhựa kích thước 40x40x40 cm; Khay nhựa để nuôi bọ gậy có kích thước30x20x5 cm; Kẹp, kim, đồng hồ đếm, đĩa petri, giấy thấm, bông thấm; Thức ăn cho bọ gậy: gan gà,men saccharomycetespha với tỉ lệ 1:3; Thức ăn cho muỗi: chuột bạch, glucose 10%, polyvitamin; Nước nuôi bọ gậy là nước khoáng, độ pH từ6,8-7,2.
 |
Phòng nuôi muỗi tại Viện |
Quy trình nuôi bọ gậy
Thả trứng muỗi vào các khay, cho nước vào tới độ cao 3 cm. Khi trứng nở thành bọ gậy tuổi 1 bắt đầu cho bọ gậy ăn cách 4 giờ /1 lần. Thức ăn của bọ gậy là hỗn hợp gan gà xay mịn trộn với mensaccharomycetes tỉ lệ 1:3. Hằng ngày đếmsố bọ gậy ở các tuổi và ghi vào phiếu theo dõi. Khi bọ gậy lột xác thành quăng,đếmsố quăng,ghi vào phiếu theo dõi, nhặt quăng cho vào lồng muỗi.
Quy trình nuôi muỗi
Sau khi quăng thành muỗi cho hút đường glucose 10% pha với polyvitamin. Hàng ngày đếmsố muỗi và ghi vào phiếu nuôi. Muỗiđược 2 ngày tuổi cho đốt máu chuột bạchvào buổi tối. Tuy nhiên có thời điểm dòng muỗi phát triển chậm thì chúng tôi cho nuỗi trực tiếp đốt người nhằm tăng khả năng đẻ trứng. Ba ngày sau đặt vỉ trứng vào lồng muỗi cho muỗi đẻ. Trứng muỗi được 3 ngày thả vào khay nhựa, cho nước tới độ cao 3cm.  |
Thả trứng muỗi vào các khay tại phòng nuôi (ảnh: Viết Hiếu) |
Quy trình giao phối muỗi
Giao phối nhân tạo
Muỗi đực và cái sau khi nở được tách ra thành các lô 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Tiến hành giao phối nhân tạo theo quy trình kỹ thuật của WHO, 1975. Theo dõi kết quả giao phối nhân tạo ở các lô thử nghiệm bằng cách mổ khoảng 10% muỗi cái xem có tinh trùng trong túi chứa tinh hay không, hoặc cho muỗi đốt máu chuột xem trứng có phát triển hay không. Xác định tuổi muỗi cái và đực có tỉ lệ giao phối thành công nhất.  |
| Giao phối nhân tạo muỗi tại labo. |
Giao phối tự nhiên
Thả muỗi cái thực địa và muỗi đực đã thuần chủng trong labo vào lồng nuôi muỗi với tỉ lệ 1:1.Mỗi lồng khoảng 100 muỗi cái và 100 muỗi đực. Sau 3-4 ngày mổ khoảng 10% muỗi cái để xác định tỉ lệ muỗi cái đã thụ tinh. Cho muỗi đốt máu chuột để trứng phát triển. Quy trình nuôi được thực hiện theo các thử nghiệm khác nhau:
-Khảo sát thời gian phát triển của bọ gậy theo nhiệt độ: Các lô được thử nghiệm trong các điều kiện nhiệt độ 17-22, 22-27, 27-32 0C. Mỗi nhiệt độ thử nghiệm 3 lô, mỗi lô có 100 con bọ gậy.Các yếu tố khác như ánh sáng, độ mặn của nước, mật độ, thức ăn …giữnguyên không can thiệp trong suốt quá trình nghiên cứu.
-Khảo sát thời gian phát triển của bọ gậy theo mật độ:Các lô được thử nghiệm trong cácđiều kiện mật độ bọ gậy trong khay từ 0,25con/ cm2 (150 con / khay); 0,5 con/cm2 (300con/ khay); 1,0 con /cm2(600con /khay).Ở mỗi mậtđộ thử nghiệm 3 lô. Các yếu tố khác như nhiệt độ, ánh sáng , độ mặn của nước, thức ăn …giữ nguyên không can thiệp trong suốt quá trình nghiên cứu.
-Khảo sát thời gian sống của muỗitheocác khoảng nhiệt độ: Quy trình nuôi được thực hiện theo 3 khoảngnhiệtđộ khác nhau từ 17-22, 22-27, 27-32 0C. Các yếu tố khác như ẩm độ, ánh sáng,thức ăn …không can thiệp trong suốt quá trình nghiên cứu .
-Khảo sát thời gian sống của muỗi theocác khoảng ẩm độ: Quy trình nuôi được thực hiện theo cácẩmđộ khác nhau từ50-70, 70-85, 85-95%.Các yếu tố khác như nhiệt độ, ánh sáng,thức ăn…không can thiệp trong suốt quá trình nghiên cứu .  |
 |
Trực tiếp cho muỗi đốt người |
Kết quả nuôi An. dirusthực địa
Thời gian phát triển, tỉ lệ chuyển pha của An. dirusthực địa
Thời gian phát triển, tỉ lệ chuyển pha của An. dirusthực địa
Pha | Số lượng trung bình | Thời gian phát triển ( ngày ) | Tỉ lệ % chuyển pha |
Trứng | 115±23,14 | 3,37±0,63 | 64,25±10,25 |
Bọ gậy | | 10,25±0,75 | 72,4±8,0 |
Quăng | | 1,37±0,15 | 85,5±7,6 |
Muỗi | | 27,25±2,25 | |
Trong điều kiều kiện nhiệt độ của phòng nuôi là25 ± 30C, ẩm độ80 ± 5%, xác địnhsố lượng trứng trung bình 1 muỗi cáiđẻ lần 1 là115 trứng, thờigian phát triển trung bình của pha trứng là3,37 ngày, tỉ lệ trứng nở thành bọ gậy tuổi 1 là64,25 %. Thời gian phát triển trung bình của pha bọ gậylà 10,25ngày, tỉ lệ bọ gậy lột xác thành quăng là 72,40%. Thời gian phát triển trung bình của phaquănglà1,37 ngày, tỉ lệquănglột xác thành muỗi là 85,5%. Thời gian sốngtrung bình của phamuỗilà27,25 ngày.
Kết quảgiao phối tự nhiênAn. dirus thực địa vàlabo
Kết quảgiao phối tự nhiênAn. dirus thực địa vàlabo
Tuổi muỗi | SL muỗi đực labo | SL muỗi cái thực địa | Thời gian phát triển trứng | SL trứng |
48 giờ | 100 | 100 | 4,5± 1,5 | 1350 |
72 giờ | 100 | 100 | 4,0±1,2 | 1820 |
96 giờ | 100 | 100 | 4,0±1,5 | 1525 |
Muỗi An.dirus đực và cái nuôi trong labo và thực địa sau khi nở 48 giờ có thể giao phối với nhau với tỉ lệ đực cái là 1:1. Thời gian phát triển pha trứng đối với muỗi độ tuổi 48 giờ trung bình là 4,5 ngày. Đối với muỗi độ tuổi 72 giờ và 96 giờ,thời gian phát triển pha trứng trung bình là 4,0 ngày. Số lượng trứng đẻ của muỗi độ tuổi 48 giờ trung bình là 13,5 trứng / 1 cá thể cái. Số lượng trứng đẻ củamuỗi độ tuổi 72 giờtrung bình là 18,2 trứng / 1 cá thể cái.Số lượng trứng đẻ củamuỗi độ tuổi96 giờ,trung bình là 15,25 trứng / 1 cá thể cái.
Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của Anopheles dirus
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phát triển của các pha trứng, bọ gậy, quăng, muỗi.
Thời gian phát triển các pha của Anopheles dirus ở3khoảng nhiệt độ
Pha (ngày) | Nhiệt độphòng |
17-22 0C | 22-27 0C | 27-32 0C |
Trứng (100) | 4,5± 1,2 | 2,5±0,6 | 2,0±0,8 |
Bọ gậy (100) | 16,5±3,2 | 12,0±3,7 | 10,0±2,9 |
Quăng (100) | 2,5±0,6 | 2,0±0,8 | 1,5±0,7 |
Trứng đến muỗi (100) | 23,5±3, 2 | 16,5±2,7 | 13,5±2,5 |
(100) : số cá thể quan sát
Kết quả bảng trêncho thấy ở mỗi nhiệt độ thí nghiệm thời gian phát triển các tuổi bọ gậy khác nhau. Điều kiện nhiệt độ phòng nuôi 17-220C,thời gian phát triển pha trứng trung bình4,5 ngày, pha bọ gậy trung bình 16,5 ngày, pha quăng trung bình là2,5 ngày. Toàn bộ giai đoạn phát triển từ pha trứng đến phamuỗikéo dài23,5 ngày. Điều kiện nhiệt độ phòng nuôi 22-270C,thời gian phát triển pha trứng trung bình2,5 ngày; pha bọ gậy trung bình12,0ngày;pha quăng trung bình là2,0 ngày. Toàn bộ giai đoạn phát triển từ pha trứng đến phamuỗikéo dài16,5 ngày. Điều kiện nhiệt độ phòng nuôi 27-320C,thời gian phát triển pha trứng trung bình2,0 ngày; pha bọ gậy trung bình10,0ngày;pha quăng trung bình là1,5 ngày. Toàn bộ giai đoạn phát triển từ pha trứng đến phamuỗikéo dài 13,5 ngày.
Ảnh hưởng của mật độ đến thời gian phát triển củabọ gậy
Thời gian phát triển của bọ gậy Anopheles dirus ở3mật độ
Mật độ | Nhiệt,ẩm độ | Thời gian phát triển (ngày) |
Lô 1 | Lô 2 | Lô 3 | X±SD |
0,25con/ cm2 150 con / khay | 25-300C,75-85% | 9,5 | 9,0 | 10,3 | 9,6±0,6 |
0,5 con/ cm2 300 con/ khay | 25-300C, 75-85% | 11,5 | 12,0 | 12,5 | 12±0,5 |
1,0 con/ cm2 600 con / khay | 25-300C, 75-85% | 13,0 | 13,5 | 13,5 | 13,3 ±0,3 |
Kết quả bảng trêncho thấy thời gian phát triển khác nhau ở cácpha tuổi bọ gậy và khác nhauở cácđiều kiện mật độ thí nghiệm. Trong điều kiện nuôi mật độ0,25 con/cm2thời gian phát triển trung bình của bọ gậylà 9,6 ngày. Trong điều kiện nuôi mật độ0,5 con/ cm2 thời gian phát triển trung bình của bọ gậylà 12,0 ngày. Trong điều kiện nuôi mật độ1,0 con/ cm2 thời gian phát triển trung bình của bọ gậylà 13,3 ngày.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian sống củamuỗi
Thời gian sống của muỗi cáiAnopheles dirus ở3 khoảng nhiệt độ
Nhiệt độ | Ẩm độ | Thời gian sống (ngày) |
Lô 1 | Lô 2 | Lô 3 | X±SD |
17-22 0C | 75-80% | 32 | 38 | 30 | 33,33±4,33 |
22-27 0C | 75-80% | 27 | 33 | 25 | 28,33±1,84 |
27-32 0C | 75-80% | 18 | 24 | 29 | 23,66±4,25 |
Trong điều kiện ẩm độ phòng nuôi muỗi được giữ ở 75-80%, nhiệt độ phòng nuôi trong khoảng 17-22 0C thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 33,33 ngày. Nếu nhiệt độ phòng nuôi trong khoảng 22-270C , thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 28,33 ngày. Nhiệt độ phòng nuôi trong khoảng 27-320C 0C, thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 23,66 ngày.
Ảnh hưởng của ẩm độ đến thời gian sống củamuỗi
Thời gian sống của muỗi cáiAnopheles dirus ở3 khoảng ẩm độ
Ẩm độ | Nhiệt độ (0C) | Thời gian sống (ngày) |
Lô 1 | Lô 2 | Lô 3 | X±SD |
60-70 % | 25-30 | 19,5 | 26,5 | 28,0 | 24,66 ±4,25 |
70-90 % | 25-30 | 34,5 | 31,5 | 42,0 | 36,00±4,28 |
90-100% | 25-30 | 25,5 | 30,5 | 28,5 | 28,16±2,63 |
Trong điều kiện nhiệt độ phòng nuôi muỗi được giữ ở 25-30 0C, ẩm độ phòng nuôi trong khoảng 60-70 % thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 24,66 ngày. Nếu ẩm độ phòng nuôi trong khoảng 70-90 %, thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 36,00 ngày. Ẩm độ phòng nuôi trong khoảng 90-100%, thời gian sống trung bình của muỗi cái Anopheles dirus là 28,16 ngày.
Bàn luận
Về thời gian, địa điểm, phương pháp thu thập An.dirus
Việc thu thập An. dirus thực địa để thuần chủng trong labo cần thực hiện vào các tháng 9, 10, 11 ở miền Trung và Tây Nguyên, là các tháng mùa mưatrùng với mùa phát triển củaAn. dirus. Địa điểm thu thập nên chọn các thôn nằm gần rừng, giữa rừng tự nhiên, nơi không có sử dụng hóa chất diệt côn trùng vì An. dirus rất nhạy với hóa chất. Phương pháp thu thập An. dirus hiệu quả nhất là mồi người ngoài nhà, phương pháp bẫy đèn trong và ngoài nhà thu được ít muỗi và muỗi không khỏe. Phương pháp bẫy gia súc không thu được nhiều muỗi vì An. dirus ít vào chuồng gia súc đốt máu.
 |
Thu thập mẫu bằng phương pháp bẫy gia súc. |
Về kỹ thuật nuôi giữ chủng An.dirus
Việc nuôi giữ chủng An.dirus có thể thực hiện bằng 2 cách: nuôi từng cá thể trong các tube nuôi muỗi, nuôi đồng loạt nhiều cá thể trong lồng. Cách thứ nhất giúp cho việc nghiên cứu xác định các đặc điểm sinh học của loài. Cách thứ hai nhằm thu được một số lượng lớn muỗi cho các thử nghiệm sinh học.
Việc giao phối muỗi để duy trìchủng trong labo có thể thực hiện theo haikỹ thuật giao phốitự nhiên và giao phối nhân tạo. Kỹ thuật giao phốitự nhiên không tốnnhiều nhân lực và thời gian, nhưng đòi hỏi phải có một dòng tự giao phối trong labo. Kỹ thuật giao phốinhân tạo giúp tạo dòng thuần trong labo nhưng có nhược điểm số lượng muỗi thế hệ F1 không nhiều do kết quả giao phối không cao. Chúng tôi chọn phương pháp giao phối tự nhiên giữa muỗi đực labo và muỗi cái thực địa. Mỗi lồng muỗi có kích thước 40x40x40cm có thể thả từ 100- 500muỗi đực, 100-500 muỗi cái. Độ tuổi muỗi đực và cáiphù hợp cho hoạt động giao phối tự nhiên từ 48 – 96 giờ. Sau khi ghép đôi 3- 4 ngày có thể mổ khoảng 10% muỗi cái để xác định tỉ lệ thụ tinh. Thời gian phát triển trứng trong điều kiện nhiệt độ từ 20-300C, ẩm độ 75-85% trung bình là 4 ngày. Số lượng trứng đẻ trung bình của 1 muỗi mẹ là 20 trứng. Số lượng trứng của muỗi An. dirus giao phối ngoài thực địa có thể từ 100-200 trứng. Như vậy phương pháp giao phối trong lồng hẹp không đạt số lượng trứng như ngoài tự nhiên.
Về các yếu tố môi trường của phòng nuôi giữ chủng An.dirus
Sự phát triển của các pha trứng, bọ gậy, quăng, muỗi phụ thuộc nhiều vào các yếu tố môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, cường độ ánh sáng, vật chủ, nước nuôi bọ gậy độ mặn, độ pH, thiên địch, vi khuẩn…Chúng tôi chọn các yếu tố nhiệt độ, ẩm độ và mật độ bọ gậy nuôi để xác định các chỉ số môi trường thích hợp khi đưa An. dirus thực địa về thuần chủng trong labo. Thời gian phát triển từ pha trứng đến muỗi phụ thuộc vào nhiệt độ. Nhiệt độ phòngtừ 22-270C, thời gian phát triển từ pha trứng đến muỗi là 16,5 ngày. Nếu nhiệt độ phòng từ 17-220C, thời gian phát triển từ pha trứng đến muỗi kéo dài 23,5 ngày, nhưng nhiệt độ phòng từ 27-320C, thời gian phát triển từ pha trứng đến muỗi rút ngắn còn 13,5 ngày. Nhiệt độ cao làm các phản ứng sinh hóa trong sinh vật xảy ra nhanh hơn, do đó thời gian phát triển của sinh vật sẽ ngắn hơn. Thời gian sống của muỗi cũng thay đổi theo nhiệt độ, ở trong khoảng nhiệt độ từ 22-270C, tuổi thọ của muỗi là 28,33 ngày. Nếu nhiệt độ phòng từ 17-220C, tuổi thọ của muỗi kéo dài 33,33 ngày, nhưng nhiệt độ phòng từ 27-320C, tuổi thọ của muỗi rút ngắn còn 23,66 ngày.
Như vậy kết hợpthời gian phát triển của các pha và tuổi thọ của muỗi, chúng tôi chọn khoảng nhiệt độ 22-270C là nhiệt độ thích hợp nhất cho labo nuôi muỗi. Tương tự,ẩm độ trong khoảng 75-85 % là thích hợp nhất để kéo dài tuổi thọ của muỗi. Mật độ bọ gậy nuôi trong các khay là một yếu tốcần khảo sát khi đưa An. dirus thực địa về thuần chủng trong labo. Mật độ bọ gậy cao kéo dài thời gian phát triển, đồng thời tỉ lệ sống sót của bọ gậy giảm. Trong điều kiện nuôi mật độ0,25 con/cm2thời gian phát triển trung bình của bọ gậy là 9,6 ngày,mật độ0,5 con/ cm2 thời gian phát triển trung bình của bọ gậylà 12,0 ngày, mật độ1,0 con/ cm2 thời gian phát triển trung bình của bọ gậylà 13,3 ngày. Chúng tôi chọn mật độ nuôi 0,25 con/cm2(150 con/ khay) là mật độ tối ưu để thuần chủng An. dirus.  |
| Thử nghiệm sinh học tại labo Viện (ảnh: Viết Hiếu) |
Kết luận
1)Thu thập An. dirus để thuần chủng trong labo cần tiến hành vào các tháng 10,11bằng phương pháp mồi người ngoài nhà.
2)An dirus thực địa cóđặc điểm: Thờigian phát triển trung bình của pha trứng là3,37 ngày, tỉ lệ trứng nở thành bọ gậy tuổi 1 là64,25 %.Thời gian phát triển trung bình của pha bọ gậylà 10,25 ngày, tỉ lệ bọ gậy lột xác thành quăng là 75,0%. Thời gian phát triển trung bình của phaquănglà1,37 ngày, tỉ lệquănglột xác thành muỗi là 85,0%. Thời gian sốngtrung bình của phamuỗilà27,25 ngày.
3)Các yếu tố môi trường cần thiết lập cho phòng nuôi muỗi An. dirus: nhiệt độ trong khoảng22-270C, ẩm độ trong khoảng 75-85 %, mật độ nuôibọ gậy 0,25 con/cm2(150 con/ khay), là các giới hạntối ưu để thuần chủng An. dirus.