|
Liệu sinh học phân tử có thể phân biệt tái phát, tái nhiễm và kháng thuốc chloroquine do Plasmodium vivax?
Sốt rét hiện vẫn còn là một bệnh phổ biến và hiện đang lưu hành tại ít nhất 99quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, nhất là tại khu vực các quốc gia châu Phi, Nam Mỹ, Đông Nam Á. Hàng năm sốt rét (SR) đã gây mắc và tử vong lên đến hàng triệu người và là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong và ảnh hưởng đến sức khỏe và phát triển kinh tế cho cộng đồng dân các vùng miền cao nguyên Việt Nam. Mặc dù, SR trong thời gian gần 10 năm qua đã giảm thấp, song khu vực miền Trung-Tây Nguyên vẫn phải đối mặt với thách thức và khó khăn do đặc điểm phức tạp: vector truyền bệnh chính vẫn tồn tại và có nguy cơ tái phục hồi, cơ cấu ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) với Plasmodium falciparum (P. falciparum) chiếm trên 80%, dân di biến động quy mô lớn nên khó có biện pháp phòng chống hiệu quả, đặc biệt tình trạng đa kháng thuốc lan rộng, dẫn đến bệnh diễn tiến nặng, tái phát nhiều, tỷ lệ chuyển SR ác tính và tử vong do SR cao hơn Sốt rét Plasmodium vivax: Bệnh nhiễm trùng nhiệt đới không lãng quên Sốt rét hiện vẫn còn là một vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng với nhiều quốc gia có SRLH nặng, gây mắc và tử vong cao ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các quốc gia châu Phi và tiểu vùng sông Mê Kông, trong đó có Việt Nam. Hàng năm sốt rét (SR) đã ảnh hưởng lên hàng triệu người, nhất là ở cận sa mạc Sahara, châu Phi, Nam Mỹ và Đông Nam Á và được xem là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong và ảnh hưởng đến sức khỏe, góp phần chậm phát triển kinh tế cho cộng đồng. Mặc dù, SR trên toàn cấu trong thời gian gần 20 năm qua đã cải thiện rất rõ với số ca mắc và tử vong giảm thấp đáng kể, song thời gian qua do nhiều nguyên nhân khác quan lẫn chủ quan cho thấy bệnh SR khiến thế giới phải đối mặt với nhiều thách thức và khó khăn, phức tạp. 
Hình 1
Việt Nam, một quốc gia có SRLH, thời gian qua cũng đạt được nhiều thành quả quan trọng trong Chương trình PCSR, song diễn tiến bệnh gần đây, đặc biệt từ đầu năm 2015 đến nay vẫn còn phức tạp với tỷ lệ BNSR và tỷ lệ KSTSR tăng đáng kể tại một số vùng trọng điểm SR trong khu vực miền Trung-Tây Nguyên và Nam bộ Lâm Đồng với nhiều yếu tố góp phần vào như sự phục hồi các vector truyền bệnh chính, tình hình KSTSR, quần thể dân di biến động, dân giao lưu biên giới, dân đi rừng ngủ rẫy quy mô lớn nên khó có biện pháp phòng chống hiệu quả. Đồng thời, phải kể đến tình trạng đa kháng thuốc SR do P. falciparum đang lan rộng tại các vùng lưu hành nặng, dẫn đến SR diễn tiến nặng, tái phát và tái nhiễm nhiều, tỷ lệ chuyển đổi từ SR thường sang SR ác tính và tử vong cao hơn. SR do P. vivax hiện đang đe dọa ít nhất 40% dân số thế giới. Hầu hết số ca này từ Đông Nam Á, châu Phi và Tây Thái Bình Dương, Nam Mỹ. KSTSR P. vivax với sự phân bố về mặt địa lý trên toàn cầu khá rộng, lên đến 2,85 tỷ người có nguy cơ nhiễm và khoảng 80 - 390 triệu ca mắc SR do P. vivax mỗi năm (trong đó 80% số ca xảy ra ở Nam Á và Đông Nam Á), kể cả SRAT và tử vong do P. vivax, có những năm tỷ lệ P. vivax chiếm đến 25-40% của gần 515 triệu ca SR chung trên toàn cầu. Về gánh nặng của bệnh, cho dù P. vivax chỉ được xem “cái bóng” của một vấn đề nghiêm trọng khác - đó là P. falciparum, nhất là tại các vùng châu Phi, châu Á, song chúng đã gây tác hại không nhỏ đến sức khỏe cộng đồng. P. vivax đã được ghi nhận truyền bệnh toàn bộ vùng nhiệt đới, ngoại trừ Tây Phi. 
Hình 2. Tương đồng giữa các chủng P. vivax dựa trên phân tích sinh học phân tử
P. vivax vẫn là một mối đe dọa sức khỏe cộng đồng quan trọng, có khả năng gây ra các đợt tái phát xa sau thời gian ngủ kéo dài, có thể gây các biến chứng, thậm chí tử vong qua nhiều báo cáo trên y văn. Trong thời gian 10 năm trở lại đây, tỷ lệ P. falciparum giảm đáng kể tại nhiều vùng và vì thế trong cơ cấu KSTSR thấy có P. vivax tăng lên tương đối ngang hoặc trội hơn, điều đó cho thấy thể ngủ tăng lên và vì thế tình trạng lan truyền sốt rét do loài này bởi muỗi sốt rét sẽ là mối quan tâm của cộng đồng khoa học, đặc biệt trong bối cảnh chúng ta đang tiến đến loại trừ sốt rét tại nhiều quốc gia thì sự gia tăng P. vivax sẽ là một thách thức. Việc loại trừ P. vivax cần phải có chiến lược mới làm thế nào xác định ổ chứa ký sinh trùng, thuốc điều trị tiệt căn an toàn và hiệu quả trên cả thể trong máu và trong tế bào gan. Hiện nay, nhóm làm việc liên quan đến P. vivax (APMEN vivax working group) đang tập trung nghiên cứu các khía cạnh này. Các nghiên cứu phần lớn tập trung phương pháp giám sát sự di chuyển của ký sinh trùng P. vivax nội tại và đi xuyên biến giới các nước vì tính di chuyển loài P. vivax lớn hơn P. falciparum, phát hiện sớm các ổ chứa và ứng phó các ổ dịch P. vivax, tiếp cận mới nhằm xác định và định lượng ổ chứa P. vivax, phát triển các chỉ điểm phân tử trong đánh giá kháng thuốc của P. vivax đối với chloroquin. Tính đa dạng của P. vivax vẫn còn cao tại các vùng tiền loại trừ sốt rét, số ca P. vivax nhập khẩu sẽ là nguồn ổ chứa quan trọng. Các nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra có mã vạch mới đối với các phân lập lâm sàng P. vivax, các hệ thống giải trình tự khác đang phát triển để xác định nguồn gốc địa lý của nhiễm trùng nhưng cần có nhiều chỉ điểm hơn. Một số nghiên cứu đã phân tích toàn bộ bộ gen của P. vivax toàn cầu để xác định các chỉ điểm mới, điều này sẽ hỗ trợ cho công tác giám sát và đưa ra biện pháp can thiệp phòng chống với loài P. vivax. 
Hình 3
Điểm đặc biệt trong chu kỳ và sự tái phát KSTSR Plasmodium vivax Trong nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc sốt rét trong điều trị nhiễm trùng P. vivax, việc xác định đâu là tái nhiễm và đâu là tái phát có thể coi là vấn đề nan giải hiện nay không những ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới, vì kể các các chuyên gia và nhà nghiên cứu chuyên về P. vivax cũngphải đang bế tắt khi trình bày tại các hội nghị quốc tế chuyên về P. vivax vì cơ chế cũng như bệnh sinh của đơn loài này rất phức tạp khi có sự tồn tại thể ngủ trong tế bào gan khi chúng thực hiện chu kỳ sinh học ở trong cơ thể người. Với sự tiến bộ khoa học, đặc biệt về sinh học phân tử, các nhà khoa học gần đây đã phân tích giải trình tự toàn bộ gen P. vivax, đồng thời nhấn mạnh “cần xem P. vivax cũng quan trọng không khác gì loài P. falciparum”. Tuy nhiên, vì đặc điểm sinh học và phát triển trong chu kỳ của loài P. vivax, khó có thể cắt được lan truyền P. vivax; nên các nhà khoa học cũng đồng ý rằng hiện với các kỹ thuật sẵn có không đủ để xác định việc điều trị tiệt căn P. vivax; nên việc phát triển các công cụ mới là một ưu tiên đầu tư. Để làm được điều đó,phải hiểu rõ chu kỳ sinh học, cơ chế bệnh sinh P. vivax. Về chu kỳ, so với loài P. falciparum thì P. vivax cũng tương tự, nghĩa là sau khi thoi trùng vào dòng tuần hoàn vào tế bào gan, ở đó chúng phân chia thành thể phân liệt mô gồm nhiều thể hoa thị. Rời tế bào gan, các merozoite này xâm nhập vào hồng cầu và sinh sản. Sau 48 giờ, đủ merozoite làm “nổ tung” hồng cầu nhiễm, dẫn đến cơn sốt. 
Hình 4. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium vivax
Một số merozoite phát triển thành thể cái và đực. Song, so với P. falciparum, thì P. vivax cũng có một số điểm khác là bản thân P. vivax thích xâm nhập vào các hồng cầu non, kích thước nhỏ. Chúng có thể tạo nên trạng thái ngủ phức tạp trong tế bào gan từ 3 tuần đến nhiều năm, rồi sau đó tái hoạt bất kỳ lúc nào, gây tái phát xa. Nghiên cứu về thể ngủ đến nay vẫn còn nhiều tranh luận và còn những điểm vẫn chưa thấu hiểu hết, do vậy nhiều tác giả đưa ra các thuật ngữ theo cách ghi nhận riêng như ngủ đông, giai đoạn ngủ dài hay thể ẩn. Chính điểm quan trọng này chỉ ra một thách thức trong nhận định tái phát (“relapse”) hay tái nhiễm (“reinfetion”) hay kháng thuốc chloroquin (CQ) thật sự do P. vivax và ngay cả khâu phân tích di truyền kháng thuốc đối với loài này cũng phức tạp hơn so với P. falciparum. P. vivax có tỷ lệ gây biến chứng ít hơn, chiếm ưu thế cao ở các vùng ôn đới và lan rộng hơn P. falciparum. 
Hình 5. Một số chủng P. vivax và thời gian dẫn đến tái phát ước tính
Khác với 4 loài Plasmodium spp. gây bệnh ở người khác, tùy thuộc vào từng chủng P. vivax (chủng Chesson, chủng Elizabeth, Madagasca, Bắc Ấn Độ, chủng Bắc Triều Tiên, chủng Hibernans sẽ có thời gian tái phát xa khác nhau, đồng thời sự tái phát này còn tùy vào vùng địa lý, nhưng không liên quan đến tình trạng miễn dịch cá nhân. Với các thông tin như trên, liệu trong nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc sốt rét do P. vivax, vai trò của sinh học phân tử và dược động học có thể giúp gì chẩn đoán gián biệt về tái phát (replase) và tái nhiễm hay nhiễm mới (reinfection/ new infection) không? Chúng tôi xin trích lược từ một số nghiên cứu liệu xem có phù hợp và chính xác của các kỹ thuật duwowisddaay không? 3. Phân tích sinh học phân tử đánh giá tái phát hoặc tái nhiễm của P. vivax? Vì các nghiên cứu phần lớn thực hiện tại các vùng sốt rét lưu hành (SRLH) nặng, mức độ và cường độ lan truyền cao của bệnh nên cần phân tích PCR để phân biệt giữa tái phát (cùng dòng KSTSR) và tái nhiễm (khác dòng KSTSR). Phát hiện và xác định loài KSTSR bằng kỹ thuật nested-PCR, phân tích kiểu gen dựa trên tính đa dạng di truyền của những kiểu gen KSTSR loài P. vivax. Dữ liệu kiểu gen các dòng KSTSR trước và sau được so sánh theo cặp. Giấy thấm Whatman3MM(loại giấy Whatman®cellulose chromatography papers 3MM, mã số Z270849) được dùng để thu mẫu máu bệnh nhân tại các thời điểm D0 và D ngày xuất hiện lại KST hay thời điểm nghi thất bại điều trị. Chelex resin 100 (bảo vệ DNA tránh tác động nhiệt trong quá trình tách DNA) và saponin dùng để tách chiết và tinh khiết DNA. Taq-polymerase, dNTPs và các cặp mồi dùng cho các phản ứng PCR. Đệm TBE 1X là một dung dịch đệm chứa hợp chất [tris base, boric acid và EDTA] thường dùng trong quy trình liên quan đến acid nucleic. Agarose gel và ethidium bromide dùng để điện di sản phẩm DNA. Một số thiết bị chuyên dụng như máy PCR, bộ điện di gel agarose 2%, máy ly tâm siêu tốc, cân phân tích và hệ thống chụp kết quả điện di gel SDS-8000. Phần mềm Labwork 3.0 dùng để phân tích ảnh kết quả điện di. Kỹ thuật Nested PCR xác định tính đa hình di truyền của P. vivax Kỹ thuật PCR lồng được áp dụng để xác định tính đa hình của P. vivax. Tất cả các phản ứng đều được tiến hành trong tổng thể tích 25µl. Cặp mồi sử dụng (mồi của hãng TAKARA Nhật Bản) 
Hình 7
Phân tích gen Pvcs
Thành phần phản ứng 10X Buffer | 2,5 µl | 25mMMgCl2 | 1,5 µl | 10mMdNTP | 0,5 µl | 10µMMồi xuôi | 1 µl | 10µMMồi ngược | 1 µl | Taq DNA polymerase (5U/ µl) | 0,1 µl | Nước tinh khiết | 17.4 µl | DNA khuôn | 2 µl (Nested:1 µl) | Tổng số | 25 µl |
Chu trình nhiệt: 95oC5’ 1 chu kỳ 94oC 1 phút
58oC 2 phút (Nested : 620)  25 chu kỳ (Nested :30) 72oC 2 phút 72oC 10 phút Đọc kết quả: Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,8%, nhuộm bằng Ethidium Bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính.  | Hình 6 |
Phân tích gen Pmsp1 Đoạn F1: Dùng kỹ thuật Nested PCR, phản ứng giai đoạn outer dùng cặp mồi VM1-O1R và VM1-N1F, giai đoạn nested dùng cặp mồi VM1-N1F và VM1-N1R. 10XBuffer | 2,5 µl | 25mMMgCl2 | 1,5 µl | 10mMdNTP | 0,5 µl | 10µMMồi xuôi | 1 µl | 10µMMồi ngược | 1 µl | Taq DNA polymerase(5U/ µl) | 0,1 µl | Nước tinh khiết | 17.4 µl | DNA khuôn | 2 µl (nested:1 µl) | Tổng số | 25 µl |
Chu trình nhiệt: Dùng cùng một chu trình nhiệt cho giai đoạn outer và nested-PCR 95oC5’ 1 chu kỳ 94oC 1 phút 68oC 2 phút  25 chu kỳ (Nested :30) 72oC 2 phút 72oC 10 phút Đọc kết quả: Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1.8%, nhuộm bằng Ethidium Bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính. Đoạn F2: Dùng kỹ thuật nested PCR, phản ứng giai đoạn outer dùng cặp mồi VM1-O2R và VM1-O2F, giai đoạn nested dùng cặp mồi VM1-O2R và VM1-N2F.
Thành phần phản ứng 10XBuffer | 2,5 µl | 25mMMgCl2 | 1,5 µl | 10mMdNTP | 0,5 µl | 10µMMồi xuôi | 1 µl | 10µMMồi ngược | 1 µl | Taq DNA polymerase (5U/µl) | 0,1 µl | Nước tinh khiết | 17.4 µl | DNA khuôn | 2 µl (Nested:1 µl) | Tổng số | 25 µl |
Chu trình nhiệt:Dùng cùng một chu trình nhiệt cho giai đoạn Outer và Nested-PCR 95oC5’ 1 chu kỳ 94oC 1 phút 60oC 2 phút(Nested : 66oC)  25 chu kỳ (Nested :35) 72oC 2 phút 72oC 10 phút Đọc kết quả: Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,2%, nhuộm bằng ethidium bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính. Đoạn F3: dùng kỹ thuật nested PCR, phản ứng giai đoạn outer dùng cặp mồi VM1-3F và VM1-3R.
Thành phần phản ứng 10XBuffer | 2,5 µl | 25mMMgCl2 | 1,5 µl | 10mMdNTP | 0,5 µl | 10µMMồi xuôi | 1 µl | 10µMMồi ngược | 1 µl | Taq DNA polymerase(5U/ µl) | 0,1 µl | Nước tinh khiết | 17.4 µl | DNA khuôn | 2 µl (nested:1 µl) | Tổng số | 25 µl |
Chu trình nhiệt (dùng cùng một chu trình nhiệt cho giai đoạn Outer và Nested) 95oC5’1 chu kỳ 94oC1 phút 66oC2 phút42 chu kỳ 72oC2 phút 72oC10 phút Đọc kết quả: Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,2%, nhuộm ethidium bromide 10 phút, sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính. Xác định và phân loại Plasmodium spp. bằng kỹ thuật PCR, với P. falciparum có băng điện di kích thước 205bp, P. vivax 120bp, P. malariae 144bp và P. ovale 786 bp. Phân tích so sánh kiểu gen và alen giữa các lam máu thu nhận vào ngày D0 với ngày mà xuất hiện lại KSTSR trong suốt quá trình theo dõi 28 ngày. Xác định tái phát khi kiểu gen và alen ở ngày D0 giống hệt kiểu gen ngày có KST tái xuất hiện và tái nhiễm khi kiểu gen và alen ở D0 khác ngày D xuất hiện lại KST. Xác định dạng phối hợp tái phát cùng với tái nhiễm khi Dtái phát vừa có kiểu gen hoặc alen mới và cũ giống nhau ngày D0. 4. Đo nồng độ CQ và chất chuyển hóa desethylchloroquin (DCQ) máu toàn phần Bình thường, chloroquin (CQ) ở nồng độ 15ng/ml (huyết tương) và 30 ng/ml (huyết thanh) được xem là nồng độ tối thiểu có hiệu lực ức chế được P. vivax. Trong khi nồng độ thuốc trong máu toàn phần thường cao hơn gấp nhiều lần so với trong huyết thanh và huyết tương. Ngoài ra, chất chuyển hóa desethylchloroquine (DCQ) cũng có thể chống lại P. vivax và nay đã được thừa nhận ngưỡng nhạy của P. vivax với CQ theo nồng độ máu toàn phần chỉ 70 - 90ng/ml (CQ + DCQ). Do đó, sự có mặt của loài KSTSR P. vivax ở nồng độ vượt 100ng/ml sẽ được xem là kháng. 
Hình 8
Lấy 100ml máu ở đầu ngón tay bằng ống mao quản chứa sẵn heparin hoặc chất chống đông EDTA, để khô trong môi trường và bỏ vào túi nhựa có khóa (có thể để được 24 tháng), gởi đi phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp. Các trường hợp xuất hiện lại P. vivax, cần đo nồng độ CQ + DCQ trong máu toàn phần, các mẫu máu được lấy vào giấy thấm whatman 3MM vào các ngày D0, D7, Dthất bại và D28. 
Hình 9
Lẽ đương nhiên, phương pháp pháp đo nồng độ CQ và DCQ tại thời điểm xuất hiện lại KSTSR sau khi điều trị và trong suốt quá trình theo dõi bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp không phải là tôi ưu vì nghiên cứu còn lệ thuộc vào các cơ quan chuyển tải và chuyển hóa thuốc và các thành phần chất chuyển hóa, vai trò của tang lách trong cơ thể, mật độ ký sinh trùng sốt rét ngày D0, cân nặng bệnh nhân khi dùng thuốc, thiếu máu hay không thiếu máu, liều lượng và tính dung nạp của thuốc,...
|
TRANG CHỦ
