Home TRANG CHỦ Thứ 2, ngày 25/09/2017
    Hỏi đáp   Diễn đàn   Sơ đồ site     Liên hệ     English
IMPE-QN
Web Sites & Commerce Giới thiệu
Web Sites & Commerce Tin tức - Sự kiện
Web Sites & Commerce Hoạt động hợp tác
Web Sites & Commerce Hoạt động đào tạo
Finance & Retail Chuyên đề
Dịch tễ học
Côn trùng học
Nghiên cứu lâm sàng & điều trị
Ký sinh trùng sốt rét
Ký sinh trùng
Sinh học phân tử
Sán lá gan
Sốt xuất huyết
Bệnh do véc tơ truyền
Dịch bệnh nguy hiểm
Sán
Giun
Web Sites & Commerce Tư vấn sức khỏe
Web Sites & Commerce Tạp chí-Ấn phẩm
Web Sites & Commerce Thư viện điện tử
Web Sites & Commerce Hoạt động đoàn thể
Web Sites & Commerce Bạn trẻ
Web Sites & Commerce Văn bản pháp quy
Số liệu thống kê
Web Sites & Commerce An toàn thực phẩm & hóa chất
Web Sites & Commerce Thầy thuốc và Danh nhân
Web Sites & Commerce Ngành Y-Vinh dự và trách nhiệm
Web Sites & Commerce Trung tâm dịch vụ
Web Sites & Commerce Góc thư giản

Tìm kiếm

Đăng nhập
Tên truy cập
Mật khẩu

WEBLINKS
Website liên kết khác
 
 
Số lượt truy cập:
3 1 7 4 1 8 4 7
Số người đang truy cập
2 6 4
 Chuyên đề Sán lá gan
Kỹ thuật xét nghiệm ELISA tìm kháng thể sán lá gan lớn

Bạn Nguyễn Thị Hoa có địa chỉ nguyenthi…@gmail.com-Hoàng Diệu, TP. Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế là sinh viên chuyên nghành thú y đang thực hiện đề tài về chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn cần hiểu rõ hơn về phương pháp và cách đọc kết quả xét nghiệm ELISA.

Đây là câu hổi của bạn Hoa cũng như của nhiều bạn đọc quan tâm khác, Ban Biên tập xin chia sẻ đến các bạn quy trình xét nghiệm ELISA chẩn đoán sán lá gan lớn và theo cách tính kết quả dựa trên mật độ quang và cách tính dựa trên hiệu giá kháng thể tính mắt thường.

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA tìm kháng thể SLGL

Dùng bộ thử ELISA phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu Fasciola spp trong huyết thanh người bị nhiễm SLGL. Bộ thử ELISA sán lá gan lớn hoạt động theo nguyên tắc phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể. Kháng nguyên Fasciola spp. đã gắn trong các giếng nhựa polystyrene tóm bắt kháng thể bám trên giếng nhựa bằng cộng hợp kháng IgG người đánh dấu men peroxidase. Kỹ thuật này gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Kháng nguyên được gắn vào giá nhựa polystyrene (đã gắn sẵn)

- Giai đoạn 2: Phủ huyết thanh bệnh nhân cần phát hiện kháng thể.

- Giai đoạn 3: Phủ cộng hợp là IgG thỏ kháng IgG người gắn men peroxydase lên phức hợp kháng nguyên - kháng thể vừa hình thành.

Cuối cùng, phủ cơ chất có bản chất là một chất hóa học để hiện màu phản ứng nếu kết quả dương tính: có màu, hoặc âm tính: không có màu hay màu rất nhạt. Trong nghiên cứu này, sử dụng kit chẩn đoán ELISA của trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh sản xuất hướng dẫn với hiệu giá kháng thể OD ≥ 1.0 được xem là dương tính. Kết quả nghiên cứu của kít có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 95,23% đã được Bộ Y tế nghiệm thu.

 

Hình 2 

Nguyên tắc hoạt động của bộ thuốc thử

Bộ thử ELISA hoạt động bằng nguyên tắc phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể. Kháng nguyên Fasciola spp đã gắn trong các giếng nhựa polystyrene tóm bắt kháng thể bám trên giếng nhựa bằng cộng hợp kháng IgG người đánh dấu men peroxidase.

Dụng cụ

Bộ micopipet: 5 cái với các thể tích hút khác nhau (0 - 5ml; 2 - 20ml; 20 - 200ml; 200 - 1000ml), loại micropipet 8 đầu(20 - 200ml); tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm; đầu eppendorf, tube lấy máu nhiều dung tích

Thành phần bộ thuốc thử

R1: Bản nhựa polystyren làm ELISA có 96 giếng, với 12 thanh, mỗi thanh 8 giếng đã gắn sẵn kháng nguyên Fasciola spp

R2: Dung dịch rữa PBS -T (Photphate buffer saline -Tween 80)

R3: Dung dịch pha loãng PBS -T-BSA (BSA: Bovis serum albumin)

R4: Cộng hợp là kháng thể kháng IgG gắn men peroxidase (HRPO).

R5a: Dung dịch pha đài chất (mono USA Ag-HBs)

R5b: đài chất OPD (Ortho-Phenylene-Diamine) hoặc TMB

R5c: Dung dịch ngưng phản ứng (acid sunfuaric loãng).

R6a: Huyết thanh chứng dương.

R6b: Huyết thanh chứng âm.

Đọc kết quả ELISA

Đọc kết quả bằng mắt thường

Chuẩn bị trước khi thực hiện phản ứng

Cứ 1 thanh 8 giếng, dùng cho 3 mẫu huyết thanh thử nghiệm, một mẫu chứng dương và một mẫu chứng âm. Cần chuẩn bị:

+ 50 ml dung dịch rửa PBS -T 1X

Pha:2,5 ml R2+47,5 ml nước cất.

+ 2 ml dung dịch pha loãng PBS -T- BSA 1X

Pha:200 ml R3+1800 ml nước cất

+ 1 ml cộng hợp chứa 1/250 cộng hợp pha trong PBS - T - BSA 1X

Pha:4 ml R4+1000 ml PBS -T-BSA 1X

+ Dung dịch đài chất: chỉ pha ngay trước khi nhỏ vào giếng, không pha trước.

Pha:0,4 mg OPD+1 ml dung dịch pha đài chất

Hoặc Pha: 80 ml TMB+800 ml dung dịch pha đài chất.

Lưu ý: nếu xuất hiện màu chứng tỏ OPD đã bị ẩm.

Tiến hành phản ứng

Với 1 huyết thanh thử nghiệm chỉ dùng 1/2 thanh gồm 4 giếng ELISA, với 3 huyết thanh thử nghiệm, dùng 1 thanh 8 giếng ELISA.

+Pha huyết thanh chứng dương, huyết thanh chứng âm, huyết thanh thử nghiệm 1/20 trong nước muối sinh lý.

Pha: 95 ml nước muối sinh lý+5 ml huyết thanh chứng dương.

Pha tương tự cho huyết thanh chứng âm và huyết thanh thử nghiệm.

+Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1).

+ Tiến hành pha loãng các huyết thanh trong các giếng ELISA theo sơ đồ sau:


Hình 3

+Đậy giếng lại bằng băng keo, ủ ở tủ ấm 37 0Ctrong 1 giờ

+Rửa giếng như bước 1.

+Cho vào giếng 100 ml cộng hợp, gãi nhẹ ở đáy giếng để trộn đều. Ủ ở tủ âm trong 1 giờ.

+Rửa giếng như bước 1.

+Cho vào giếng 100 ml dung dịch đài chất, gãi nhẹ để trong tối. Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 300C trong 5 -15 phút, một khi màu đã phân biệt rõ chứng dương và chứng âm thì làm ngừng phản ứng màu bằng 50ml dung dịch R5c.

Đọc kết quả

Dựa vào độ đậm nhạt theo chứng (+) thì tùy kinh nghiệm trả lời hiệu giá kháng thể là bao nhiêu. Dương tính được ghi với hiệu giá kháng thể 1/3.200 -1/12.800. Nếu muốn hiệu giá chính xác thì có thể tiến hành pha loãng huyết thanh thử ở độ pha loãng cao hơn. Một số lưu ý:

+ Vì kháng thể tồn tại kéo dài sau điều trị thành công, nên không tiện dùng ELISA để theo dõi bệnh;

+ Không có phản ứng chéo với sán lá gan nhỏ, ung thư gan, viêm gan nhưng có phản ứng chéo với một số tác nhân đơn bào amip, sán lá phổi và sán máng.


Hình ảnh so màu của phản ứng ELISA đọc bằng mắt thường.

Đọc bằng máy (có máy đọc ELISA)

Chuẩn bị trước khi thực hiện phản ứng

Chuẩn bị 8 mẫu chứng âm, 1 mẫu chứng dương và huyết thanh thử nghiệm. Pha hóa chất tùy theo số lượng huyết thanh thử nghiệm, mỗi một thanh 8 giếng cần chuẩn bị:

+ 50 ml dung dịch rửa PBS - T 1X

Pha:2,5 ml R2+47,5 ml nước cất

+ 2 ml dung dịch pha loãng PBS - T - BSA 1X

Pha:200 ml R3+1800 ml nước cất

+1 ml cộng hợp chứa 6/1000 cộng hợp pha trong PBS - T- BSA 1X

Pha:6 ml R4+1000 ml PBS -T-BSA 1X

+Dung dịch đài chất: chỉ pha ngay trước khi nhỏ vào giếng, không pha trước.

Pha:0,4 mg OPD+1 ml dung dịch pha đài chất.

HoặcPha:80 ml TMB+800 ml dung dịch pha đài chất.

Lưu ý: nếu xuất hiện màu chứng tỏ OPD đã bị ẩm.

Tiến hành phản ứng

+Sử dụng 1 thanh 8 giếng cho 8 mẫu chứng âm, dùng thanh khác cho huyết thanh chứng dương và huyết thanh thử nghiệm.

+Pha huyết thanh chứng dương, huyết thanh chứng âm, huyết thanh thử nghiệm 1/80 trong nước muối sinh lý.

Pha:1580 ml nước cất+20 ml huyết thanh chứng (+).

Pha tương tự cho huyết thanh chứng (-) và huyết thanh thử nghiệm.

+Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1).

+Cho vào mỗi giếng 90 ml PBS - T - BSA 1X

+Tiếp tục cho vào mỗi giếng 10 ml huyết thanh chứng (-), huyết thanh chứng (+), huyết thanh thử nghiệm đã pha loãng.

+Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1).

+Đậy giếng lại bằng băng keo, ủ ở tủ ấm 37 0C trong trong 1 giờ.

+Rửa giếng như bước 1.

+Cho vào giếng 100 ml cộng hợp, chạm nhẹ ở đáy giếng để trộn đều;

+Ủ ở tủ ấm trong 1 giờ.

+Rửa giếng như bước 1.

+Cho vào giếng 100 ml dung dịch đài chất, gãi nhẹ để trong tối. Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 300C trong 5 -15 phút, một khi màu đã phân biệt rõ chứng dương và chứng âm thì làm ngừng phản ứng màu bằng 50 ml dung dịch R5c.

Đọc kết quả

-Sử dụng kết hợp 2 loại kính lọc với bước sóng 450 nm và 620 nm.

-Tùy máy đọc ELISA, có thể đọc theo mật độ quang hoặc đọc theo nồng độ

-Đọc theo mật độ quang:

+Đọc và ghi kết quả trị số OD của từng giếng

+Tính trung bình cộng trị số OD của các mẫu chứng âm và độ lệch chuẩn

Ngưỡng dương tính = Trung bình cộng trị số OD âm tính + 3SD
 

-Đọc theo nồng độ: kết quả dương tính được ghi từ 1/3200 - 1/12.800.

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp đọc theo mật độ quang, độ chính xác phương pháp này cao hơn so với đọc bằng mắt thường.

 

Ngày 07/11/2016
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang  

THÔNG BÁO

   Dịch vụ khám chữa bệnh chuyên ngành của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Quy Nhơn thuộc Bộ Y tế về các bệnh ký sinh trùng và các bệnh do véc tơ truyền, đặc biệt là các bệnh ký sinh trùng mới nổi như sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn, giun đũa chó và các bệnh thông thường khác; khám bảo hiểm y tế và xét nghiệm chẩn đoán bệnh bằng các phương tiện kỹ thuật cao như sinh hóa, huyết học, miễn dịch (ELISA), sinh học phân tử và chẩn đoán hình ảnh bằng nội soi tiêu hóa, siêu âm màu…

   Trung tâm Dịch vụ khoa học kỹ thuật của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Quy Nhơn thuộc Bộ Y tế chuyên sản xuất mua bán hóa chất, vật tư, chế phẩm diệt côn trùng; dịch vụ diệt côn trùng gây bệnh, côn trùng gia dụng như muỗi, ruồi, gián, kiến…; dịch vụ phòng diệt mối mọt và xét nghiệm phát hiện tôm bằng các kỹ thuật hiện đại.


 KẾT QUẢ TUYỂN SINH
 CHUYÊN ĐỀ
 CÁC VẤN ĐỀ QUAN TÂM
 LOẠI HÌNH DỊCH VỤ
 PHẦN MỀM LIÊN KẾT
 QUẢNG CÁO

Trang tin điện tử Viện Sốt rét - Ký Sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn
Giấy phép thiết lập số 53/GP - BC do Bộ văn hóa thông tin cấp ngày 24/4/2005
Địa chỉ: Khu vực 8-Phường Nhơn Phú-Tp. Quy Nhơn- Tỉnh Bình Định.
Tel: (84) 056 3547492 - Fax: (84) 056 3647464
Email: impe.quynhon@gmail.com
Trưởng ban biên tập: TTND.PGS.TS. Nguyễn Văn Chương - Viện trưởng
Phó Trưởng ban biên tập: TS.BS.Huỳnh Hồng Quang-Phó Viện trưởng
• Thiết kế bởi công ty cổ phần phần mềm: Quảng Ích