|
Ứng dụng hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký lỏng ghép khối phổ (HPLC/MS) trong kiểm tra chất lượng và đánh giá kháng thuốc
Giới thiệu về Hệ thống sắc ký lỏng cao áp, khối phổ và sắc ký lỏng ghép khối phổ Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography), đôi khi gọi là High-pressure liquid chromatography_HPLC) là một kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry) và sinh hóa (biochemistry) với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất. HPLC cũng được xem là một kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lượng (gravitimetric technique). HPLC có nhiều ứng dụng bao gồm y học (ví dụ phát hiện nồng độ vitamine D trong huyết thanh), trong pháp luật (ví dụ phát hiện các thuốc làm tăng lực trong nước tiểu), trong nghiên cứu (ví dụ tính khiết chất từ mẫu sinh học phức hợp, hoặc tách các chất tổng hợp giống nhau từ các chất khác) và trong sản xuất (ví dụ trong tiến trình sản xuất các chế phẩm sinh học hoặc dược). HPLC có thể lựa chọn mô tả như một sự lựa chọn liên quan sự hút bám hàng loạt trong hóa học. HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng đẻ tải một chất hỗn hợp đơn giản vào cột hóa học, qua đó quá trình phân tách xảy ra. Một cột phân tách HPLC được làm đầy bởi các nguyên tử rắn (như silica, polymers hay chất hấp phụ) và hỗn hợp mẫu được phân tích thành những hợp chất tương tác với các nguyên tử trong cột. Sự phân tách HPLC bị ảnh hưởng bởi điều kiện của các dung môi lỏng (như áp suất và nhiệt độ), tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môi lỏng (như tính không ưa nước, quá trình proton hóa, v.v) và tương tác hóa học giữa các hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand, trao đổi ion,…). HPLC được phân biệt với các phương pháp sắc ký thông thường vì áp lực của HPLC tương đối cao (~150 bar, ~2000 PSI) trong khi sắc ký thông thường phần lớn dựa vào lực của trọng lực cung cấp áp lực. Do điều kiện phân tách dưới áp lực cao của HPLC, nên cột của HPLC có đường kính trong tương đối nhỏ (ví dụ 4.6 mm) ngắn (250 mm) và đặc hơn với các nguyên tử nhỏ hơn, giúp cho quá trình phân tích tối ưu hợp chất mẫu hơn là sắc ký thông thường. Điều này cho thấy HPLC ưu thế trong giải quyết khi phân tích các hợp chất, giải thích tại sao ngày càng nhiều ứng dụng đối với HPLC. Giản đồ của thiết bị HPLC điển hình bao gồm một bộ phận phân tích mẫu mà ở đó các hợp chất mẫu được đưa vào hệ thống HPLC, một hay nhiều bơm cơ học dùng cho việc đẩy chất lỏng thông qua hệ thống tubing, một cột phân tách, một đầu dò phân tích số hóa (digital analyte detector) như UV/Vis hay photodiode array (PDA) để phân tích định tính hoặc định lượng và một microprocessor số để kiểm soát các thành phần hay bộ phận của hệ thống HPLC và một phần mềm sử dụng. Nhiều loại cột khác nhau sẵn có với kích cỡ và loại khác nhau (như trong hóa học) của các loại nguyên tử rắn, đặc. Một số kiểu bơm cơ học trong một thiết bị HPLC cũng có thể trộn nhiều chất lỏng với nhau và thực hiện hay gradient các chất lỏng đó có thể cải tiến tương tác hóa học xảy ra trong các cột HPLCvà bằng cách ấy chúng sẽ phân tích các hợp chất. Đo khối phổ (Mass spectrometry_MS)Đo khối phổ là hay Mass spectrometry (MS) là một kỹ thuật phân tích trong đó đo tỷ số “mass-to-charge ratio” của các phân tử mang điện tích. Người ta sử dụng chúng để xác định khối các phân tử, để xác định các thành phần nguyên tố của mẫu hoặc của phân tử và làm sáng tổ cấu trúc hóa học của phân tử, như là các peptides và hợp chất hóa học khác. MS làm việc nhờ vào các hợ chất hóa học ion hóa thanh các phân tử tích điện hoặc các phần của phân tử (molecule fragments) và đo tỷ số mass-to-charge ratios của chúng. Trong một quy trình đo khối phổ điển hình: Một mẫu được tải vào trong hệ thống MS và thực hiện quá trình hóa thành hơi (vaporization). Các thành phần của mẫu được ion hóa nhờ một số phương pháp (ví dụ tác động lên chúng với các bức xạ electron), dẫn đến kết quả hình thành các nguyên tử sạc (ions). Các ion đươc phân tích và đo chỉ số mass-to-charge ratio trong bộ phận phân tích nhờ vào điện từ trường (electromagnetic fields). Các ion sẽ được phát hiện thường bằng phương pháp định lượng. Các tín hiệu ion sẽ chuyển thành khối phổ (mass spectra). Ngoài ra, các thiết bị MS bao gồm 3 modules: 1.Một nguồn ion có thể chuyển pha khí các nguyên tử mẫu thành ion ion (hoặc trong trường hợp ion hóa phun điện tích (electrospray ionization), chuyển ion trong pha khí; 2.Một hệ thống phân tích khối sắp xếp các ion nhờ vào các khối bằng cách ứng dụng điện từ trường (electromagnetic fields); 3.Một đầu do đo các giá trị của số lượng indicator và do vậy cung cấp dữ liệu để tính số lượng từng ion hiện diện. Kỹ thuật đã sử dụng cả định tính và định lượng. Điều này bao gồm cả xác định các hợp chất chưa biết, xác định các thành phần cấu trúc isotopic của các phần tử trong một nguyên tử và xác định cấu trúc của một hợp chất nhờ vào quá trình phân mảnh các hợp chất. Các ứng dụng khác gồm xác định số lượng trong một hợp chất hay nghiên cứu nền tảng của pha khí của chất hóa học ion (đặc tính hóa học của ion và sự trung tính trong chân không). MS giờ đây được sử dụng rất phổ biến tại các la bô phân tích nghiên cứu lý học, hóa học và đặc tính sinh học của phần lớn các hợp chất khác nhau. Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (HPLC/MS) Sắc ký ghép khối phổi hay tên tiếng Anh là Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/ hoặc HPLC-MS) là một kỹ thuật hóa học mà gắn kết tiềm năng phân tích lý học của sắc ký lỏng (hay HPLC) với một khả năng phân tích khối (mass analysis) của cơ chế khối phổ (mass spectrometry). Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng sử dụng trong nhiều ứng dụng có độ nhạy và tính chọn lọc cao. Nhìn chung các ứng dụng đó có định hướng phát hiện chung và xác định các chất hóa học trong sự có mặt của các chất hóa học khác (trong một hợp chất phức tạp). Hệ thống chuẩn bị công việc của LC-MS có thể dùng làm tính khiết các khối và nhanh của các chất chiết xuất trong tự nhiên và các phân tử mới quan trọng với thực phẩm, dược phẩm, hóa chất nông nghiệp và ngành công nghiệp khác. Hạn chế của LC-MS là phân tích / sàng lọc thuốc trong nước tiểu thường khó có thể phân biệt giữa các chất chuyển hóa đặc biệt với nhau, đặc biệt với hydrocodone và các chất chuyển hóa của nó. Phân tích nước tiểu bằng LC-MS được dùng để phát hiện các phân loại đặc biệt cho thuốc. Tuy nhiên, sắc ký khí (Gas chromatography_GC-MS) nên được sử dụng khi phát hiện các thuốc đặc hiệu và chất chuyển hóa khi yêu cầu. 1.1. Phân tích và đánh giá chất lượng thuốc (thuốc giả và thuốc kém chất lượng) Nghiên cứu đánh giá chất lương thuốc (thuốc kém chất lượng và thuốc giả) trước đây (năm 2006, 2007, 2009) đã thực hiện theo chương trình Dự án Quỹ toàn cầu và Dự án USAIDS và một ít kinh phí nhỏ từ ngân sách cơ quan để phân tích các chỉ số chất lượng thuốc sốt rét và các nhóm thuốc điều trị bệnh nhiễm trùng (anti-infectious medicines) theo một số phương pháp cảm quan(phương pháp cơ bản), phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC_Thin Layer Chromatography) nhưng chỉ mang tính chất đánh giả kết quả là định tính và bán định lượng. Hiện nay, việc phân định thuốc giả và kém chất lượng cần đánh giá thêm một số kỹ thuật và máy móc hiện đại hơn, trong đó có máy Sắc ký lỏng cao áp (HPLC_High performance Liquid Chromatography) hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ (HPLC/MS_ High performance Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry). Nhằm góp phần bổ sung dữ liệu nghiên cứu cũng như đánh giá về thực trạng thuốc giả và thuốc kém chất lượng, nhất là nhóm thuốc chống nhiễm trùng. Chúng tôi xin đề nghị mua thiết bị HPLC và HPLC/MS -Nhóm các thuốc điều trị bệnh sốt rét (artesunate viên nén, chloroquine và quinine viên); -Nhóm các thuốc điều trị bệnh giun sán (albendazole, mebendazole, praziquantel, ivermectine, thiabendazole); -Nhóm các thuốc kháng sinh (nhất là các thuốc đắt tiền và từ thương hiệu các công ty dược có tiếng trên thế giới) -Nhóm thuốc chống lao (INH, Pyrazinamide, Ethambutol, Streptomycine) -Nhóm thuốc trị bệnh truyền nhiễm khác (Tamiflu, Lamivudine, Interferon) 1.2. Nghiên cứu phân tích kháng thuốc điều trị Một trong những vấn đề khó khăn trong kháng thuốc chloroquine do Plasmodium vivax hiện nay là không phân định được tái phát hay tái nhiễm lại tác nhân gây bệnh sau khi đã hoàn tất liệu trình điều trị, ngay cả kỹ thuật sinh học phân tử như PCR cũng khó phân biệt vì vốn dĩ chu kỳ sinh học của Plasmodium vivax là có thể ngủ và tái hoạt thể ngủ nên không thể đánh giá thấu đáo tái phát (relapse) hay tái nhiễm (reinfection) đối với loài KSTSR này. Song song với nghiên cứu trên điều kiện in vivo và in vitro, phân tích về gen học của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc cũng quan trọng không kém và trong một số trường hợp sẽ quyết định kết quả nghiên cứu đánh giá. Vì đây là các nghiên cứu trên các vùng sốt rét lưu hành nặng, hoặc rất nặng có tính lan truyền bệnh cao nên cần phân tích về mặt gen học phân tử như PCR để phân biệt giữa tái phát (cùng dòng KSTSR) và tái nhiễm (khác dòng KSTSR), song khâu phân biệt giữa tái phát, tái nhiễm là không thể nếu nhiễm phải P. vivax khi chỉ phân tích dựa trên lâm sàng. Do vậy, chỉ có thể phân tích dựa trên kiểu gen may ra mới nhận định được (Chen và cs., 2007; Imwong và cs., 2007). Một khó khăn khác cho kỹ thuật PCR trong khi áp dụng cho các thử nghiệm đánh giá thử nghiệm thuốc lâm sàng đối với P. vivax vì tái phát thật sự gây ra bởi thể ngủ tái hoạt động không thể xác định hoặc loại trừ được (WHO., 2008). Gần đây, trên thế giới tại một số trung tâm nghiên cứu về kháng thuốc đã tập trung vào một khía cạnh nghiên cứu sâu hơn chính là thử đo nồng độ thuốc /chất chuyển hóa của thuốc trong máu toàn phần để nhận định kháng / nhạy cho thấu đáo hơn. Bình thường, chloroquine ở nồng độ 15ng/ml (trong huyết tương) và 30ng/ml (trong huyết thanh) được xem là nồng độ tối thiểu có hiệu lực ức chế được P. vivax. Trong khi nồng độ thuốc trong máu toàn phần thường cao hơn gấp nhiều lần so với trong huyết thanh và huyết tương. Ngoài ra, chất chuyển hóa monodesethylchloroquine cũng có thể chống lại P. vivax và nay đã được thừa nhận ngưỡng nhạy của P. vivax với chloroquine theo nồng độ máu toàn phần chỉ 70-90 ng/ml (chloroquine và desethylchloroquine_CQ-DCQ). Do đó, sự có mặt của ký sinh trùng ở nòng độ thuốc vượt 100ng/ml sẽ được xem là kháng. Chúng ta có thể lấy 75-100 microlit máu vào trong tube hoặc nhỏ giọt trên giấy thấp và bảo quản khô cho đến khi phân tích Các trường hợp xuất hiện lại P. vivax, cần đo nồng độ CQ trong máu toàn phần, các mẫu máu được lấy vào giấy thấm Whatman 31ETchr vào các ngày D0, D7, D thất bại và D28. Lấy 100ml máu đầu ngoán tay bằng ống mao quản chứa sẵn heparin hoặc chất chống đông EDTA, để khô trong môi trường và bỏ vào túi plastic có khóa (có thể để được 24 tháng), sau đó gởi đi phân tích bằng máy HPLC (Agilent 1200 series, Agilent Technologies, Germany) theo quy trình phương pháp của Bell và cộng sự (2007). Hệ thống sắc ký lỏng của HPLC sử dụng là cột phân tích trong pha nghịch ZORBAX Ecllpse XDB-C18 (4.6 × 150mm ID, 5 μm), với tốc độ dòng chảy 1ml/phút, pha động isocratic chứa nước đã khử ion, acetonitrile và triethylamine theo tỷ lệ 90%, 10% và 1%. Theo Chương trình phòng chống sốt rét toàn cầu (Global Malaria Programme_GMP) và Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation_WHO) cho phép và hướng dẫn trong đánh giá nhạy kháng thuốc chloroquine do Plasmodium vivax, chỉ số tổng nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ) sau khi điều trị 3 ngày và trong quá trình theo dõi 28 ngày vẫn còn KSTSR Plasmodium vivax mà tại thời điểm đó nồng độ CQ+DCQ ≥ 90 ng/ml là một chỉ điểm (marker) nghi ngờ kháng thuốc. Do đó, việc phân tích xác định nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ) trong máu bệnh nhân trong và sau điều trị bằng máy HPLC và HPLC/MS là rất cần thiết trong đánh giá nhạy - kháng thuốc, để đưa ra các thay đổi chính sách thuốc sốt rét phù hợp từng giai đoạn. Việc nghiên cứu phân bố của CQ và DCQ trong máu, huyết tương và hồng cầu trên những cá nhân khỏe mạnh tình nguyện và bệnh nhân sốt rét đã được nghiên cứu từ nhiều năm qua sử dụng hệ thống HPLC đo nồng độ Chloroquine (Cq) và desethyl-chloroquine (CqM) với HPLC và các kết quả đang mang lại nhiều khía cạnh quan trọng đánh giá nhạy kháng thuốc cũng như một số chỉ số thông số dược động học về thuốc sốt rét loại CQ (1.3. Phân tích và đánh giá dược động học trên súc vật thực nghiệm được thử thuốc Hầu hết các đơn vị nghiên cứu nên song song với công tác đánh giá hiệu lực/ hiệu quả các thuốc đang sử dụng trong chương trình quốc gia thì việc nghiên cứu định liều và đánh giá hiệu lực/ hiệu quả một số loại thuốc mới trong điều trị sốt rét và bệnh ký sinh trùng trước khi tiến hành trên người là thử nghiệm trên súc vật thực nghiệm. Do đó, nếu có thiết bị HPLC và HPLC/MS là một trong những công cụ hỗ trợ rất lớn cho nghiên cứu trên súc vật thực nghiệm (như chuột, thỏ) về mặt đánh giá một số thông số dược động học.
|
TRANG CHỦ
