Trong 5 năm trở lại đây, việc xuất hiện một chủng ký sinh trùng thứ năm ở người-Plasmodium knowlesi trên các vùng sốt rét gây ra thêm một thách thức mới trong phòng chống và tiến tới loại trừ sốt rét, đặc biệt tại các quốc gia có sự lưu hành loài này.

Gần đây, nhóm tác giả gồm AmirahAmir, BruceRussell,JonathanWee KentLiew, RobertW.Moon,MunYikFong, IndraVythilingam,VellayanSubramaniam,GeorgesSnounouvà YeeLingLau đang công tác tại khoa ký sinh trùng, đại học y khoa Malaya,KualaLumpur, Malaysia và khoa vi sinh học của đại học y khoa YongLooLin, đại học quốc gia Singapore, Khoa miễn dịch và nhiễm trùng của Trung tâm y học nhiệt đới, Đại học y khoa Hoàng gia Anh,khoa dược và hóa của đại học TeknologiMARA,Puncak AlamCampus,BandarPuncakAlam,Selangor,Malaysia, đại học Sorbonne, Paris06,INSERM (InstitutNationaldelaSantéetdelaRechercheMedicale), Pháp cùng tiến hành nghiên cứu về một dòng ký sinh trùng Plasmodium knowlesi xâm nhập từ người.

Plasmodiumknowlesitrước đây được sử dụng rộng rãi như một mô hình sốt rét quan trọng và giờ đây chúng được nhận ra như một tác nhân gây sốt rét quan trọng ở người tại Malaysia. Chủng P.knowlesihiện đang sử dụng để nghiên cứu được phân lập cách nay nhiều thập niên, nay đang là mối quan tâm và xem chúng như chưa bao giờ hiện diện trong quần thể ký sinh trùng. Các nhà khoa học đã phân lập được một dòng P. knowlesi mới (tạm gọi là dòng UM01) từ một bệnh nhân nhập viện tại Kuala Lumpur, Malaysia và so sánh với dòng P. knowlesi H được phân lập từ phòng thí nghiệm có tính thích nghi con người (A1-H.1). Các dòng UM01 và A1-H.1 dễ dàng xâm nhập vào các hồng cầu bình thường trong máu người và của khỉ đuôi dài Macaca fascicularis và chúng có ái tính đối với hồng cầu lưới. Trong khi sự xâm nhập vào các tế bào hồng cầu ở người phụ thuộc vào sự hiện diện của thụ thể kháng nguyên Duffy trên chemokine (Duffyantigen/receptorforchemokines_DARC) của hai dòng ký sinh trùng, điều này không xảy ra trên các tế bào hồng cầu khỉ. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu cũng đã lưu ý về sự khác biệt của cơ chế tác động xâm nhập, cơ chế sản sinh giao bào và thời gian của chu kỳ vô tính giữa hai dòng này. Việc phân lập và mô tả các dòng P. knowlesi để sử dụng trong các điều tra thực nghiệm về loài ký sinh trùng truyền từ động vật sang người là rất cần thiết trong thời gian tới.

H1

Plasmodium knowlesi lần đầu tiên được mô tả chính thức ở Ấn Độ vào đầu những năm 1930 trong một mẫu xét nghiệm khỉ đuôi dài Macaca fascicularis từ Singapore. Trong khi ký sinh trùng này gây nhiễm nhẹ and mạn tính ở các vật chủ tự nhiên của nó (khỉ đuôi dài M. fascicularis và khỉ đuôi lợn M. nemestrina), các lây nhiễm do P. knowlesi ở khỉ Rhesus (M. mulatta) khởi phát đột ngột và thường gây tử vong nhanh chóng nếu không được điều trị do chu kỳ thể vô tính cũng ngắn như P. falciparum. Do có thể dễ dàng duy trì sự sống và lan truyền trong phòng thí nghiệm nên ký sinh trùng này trở thành một mô hình được ưa chuộng của nhiều điều tra về miễn dịch học, sinh lý học và hóa trị liệu. Qua nhiều năm, các chủng khác đã được phân lập từ động vật hoặc muỗi anophel ở Malaysia và các quốc gia lân cận và một vài trong số chúng được sử dụng cho nghiên cứu sốt rét.

H2

Ngay sau khi phân lập ban đầu chủng P. knowlesi, người ta phát hiện rằng con người dễ bị gây nhiễm thực nghiệm bởi P. knowlesi mà ở một số người còn dẫn tới các triệu chứng ác tính. Ca lây nhiễm tự nhiên xác định đầu tiên ở người chỉ được ghi nhận ba mươi năm sau đó, theo đó cung cấp bằng chứng đầu tiên về một trường hợp nhiễm sốt rét từ động vật sang người. Dòng gây nhiễm (chủng H) từ ca bệnh này được phân lập và vẫn đang được sử dụng cho nghiên cứu khoa học. Trong những năm gần đây, một ổ bệnh sốt rét do P. knowlesi được phát hiện tại bang Sarawak. Hiện nay loài này là nguyên nhân gây sốt rét quan trọng nhất trong dân cư ở bán đảo Malaysia, Sarawak và Sabah, cùng các ca bệnh đôi khi được ghi nhận từ các nước láng giềng - nơi mà các vật chủ chính giống khỉ đuôi dài tự nhiên xuất hiện.

Tiềm năng lây nhiễm từ động vật sang người của P. knowlesi được nhấn mạnh giá trị của loài này đối với nghiên cứu cơ bản về sinh học của ký sinh trùng sốt rét. Đáng chú ý nhất, hiện tượng biến đổi kháng nguyên sốt rét lần đầu tiên được phát hiện nhờ loài P. knowlesi và các nghiên cứu có ảnh hưởng sâu xa về sự xâm nhập vào các tế bào hồng cầu bởi các thể hoa thị đều dựa trên P.knowlesi và đã đưa đến minh chứng đầu tiên về yêu cầu tuyệt đối đối với thụ thể Duffy cho sự xâm nhập hồng cầu của một ký sinh trùng sốt rét.

Ngoại trừ một số xét nghiệm quá trình kết dính tế bào (cytoadherence) và độ nhạy thuốc trên ex vivo gần đây sử dụng các phân lập thu thập trên thực địa, thì phần lớn các điều tra được tiến hành với P. knowlesi đều sử dụng các chủng mà chủ yếu đã được duy trì trong chủng khỉ vàng M. mulatta trong khoảng thời gian nửa thế kỷ qua hoặc lâu hơn. Gần đây, sự tuân theo của P. knowlesi đối với kỹ thuật di truyền đã thúc đẩy các nỗ lực thành công để làm cho chủng-H thích nghi với nuôi cấy liên tục lâu dài trong môi trường tế bào hồng cầu người mà từ đó các dòng vô tính được tạo ra. Các giai đoạn nhân giống lâu như vậy ở các tế bào từ các vật chủ không tự nhiên có thể làm thay đổi các đặc tính của ký sinh trùng. Trong báo cáo này, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một dòng P. knowlesi (hay dòng UM01) từ một bệnh nhân bị lây nhiễm gần đây và sau đó nhân rộng nó sang khỉ đuôi dài M. fascicularis không có miễn dịch bị bắt giữ, đây là loài vật chủ tự nhiên. Dòng này sau đó được đem so sánh một số đặc điểm xâm nhập của nó với một trong những dòng vô tính của chủng H (A1-H.1) đã được làm thích nghi với các tế bào hồng cầu người.

Một số kết quả nghiên cứu

Phân lập chủng P. knowlesi mới

Vào năm 2013, một phụ nữ 23 tuổi có tiền sử sốt 6 ngày đến tại Trung tâm y tế đại học Malaya, bệnh nhân có thể bị nhiễm bệnh trong một khu rừng ở quận Hulu Langat-Selangor, Malaysia một vài tuần trước khi nhập viện. Xét nghiệm lam máu cho thấy mật độ ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) P. knowlesi nhiễm là 0,25%, sau đó đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR (Singh và cs.,). Một mẫu máu được thu thập để bảo quản lạnh như dòng UM01.

H3

Một tháng sau, một mẫu được rã đông trước khi được cấy vào một con khỉ đuôi dài M. fascicularis chưa bị sốt rét (khỉ A, Hình 1). Tám ngày sau khi gây nhiễm, khi mật độ ký sinh trùng là 2,6% (chủ yếu là ký sinh trùng giai đoạn thể tư dưỡng già) tiến hành ủ trong thử nghiệm ex vivo với 2 mL máu toàn phần trong 15 giờ, trong suốt thời gian đó các ký sinh trùng trưởng thành thành các thể phân liệt mô và sau đó giải phóng các merozoites xâm nhập làm tăng gấp hai lần mật độ ký sinh trùng. Các ký sinh trùng giai đoạn thể nhẫn xuất hiện phần lớn sau đó được bảo quản lạnh và một trong những thể ổn định này từ đoạn đầu tiên sau đó được rã đông để gây nhiễm ba khỉ đuôi dài M. fascicularis chưa mắc sốt rét (khỉ B, C và khỉ D). Qua thời gian 10 ngày sau khi gây nhiễm, thu thập 10aliquots 1 mL (mật độ nhiễm ký sinh trùng P. knowlesi từ 2-15%) từ mỗi con khỉ và được hoặc trữ lạnh hoặc ngay lập tức sử dụng trong các xét nghiệm xâm nhập trên thử nghiệm ex vivo (Hình 1). Quá trình phát triển vô tính đầy đủ của dòng UM01 luôn nhất quán là 24 tiếng (chênh lệch +/- 1 tiếng) trong các điều kiện trưởng thành trên ex vivo phù hợp các điều kiện quan sát được trên in vivo ở khỉ.

Thử nghiệm xâm nhập Ex vivo

Phì đại hồng cầu và đặc hiệu loài: Các nhà khoa học xác định có hay không dòng UM01có biểu thị bất cứ ưu tiên nào khi xâm nhập vào các tế bào hồng cầu người hoặc khỉ đuôi dài M. fascicularis hay không. Chúng tôi cũng tập trung mô tả bất kỳ ái tính nào hướng đến các loại tế bào hồng cầu đối với những vật chủ này, sử dụng dòng A1-H.1 làm mẫu so sánh. Ba xét nghiệm ex vivo được tiến hành một cách độc lập cho thấy rằng các dòng UM01 và A1-H.1 xâm nhập cả hồng cầubình thường và hồng cầu lưới với tính ưa thích hồng cầu lưới ở cả hai loài vật chủ (hình 2 và bảng bổ sung S1). Các hồng cầu bình thường của khỉ và người bị cả hai dòng P.knowlesi xâm nhập đến mức độ tương tự nhau.

Trong suốt quá trình diễn ra các thí nghiệm, các giao bào dễ dàng quan sát thấy trong tất cả các thí nghiệm ex vivo liên quan đến dòng UM01, nhưng lại không quan sát được ở các thí nghiệm sử dụng dòng A1-H.1. Vì loài P. knowlesi trải qua quá trình hình thành giao tử ngắn kinh điển quan sát được ở hầu hết các loài ký sinh trùng sốt rét (ngoại lệ đối với P. falciparum) nên chỉ những dạng tương đối trưởng thành mới có thể dễ dàng xác định được. Nuôi cấy ngắn hạn dòng UM01 biểu thị một tỷ lệ chuyển đổi giao bào là 2,0 ± 2,4 (bảng 1). Do cường độ nhuộm giữa các tiêu bản có sự khác nhau nên chúng tôi không đủ tự tin để phân biệt giữa giao bào đực và giao bào cái (Hình 3).

H4

Các xét nghiệm ức chế xâm nhập

Đặc điểm phụ thuộc thụ thể kháng nguyên Duffy đối với các chemokines (TheDuffyantigen/receptorforchemokines_DARC) của các chủng P. knowlesi, như chủng H thể hiện rõ ràng ở người và khỉ vàng M. mulatta. Do đó, chúng tôi đã tìm cách để mô tả sự phụ thuộc thụ thể DARC của dòng UM01 của P. knowlesi mới cho cả hồng cầu bình thường người và khỉ đuôi dài M. fascicularis. Các tế bào hồng cầu âm tính DARC (được thu thập từ những người hiến máu ở châu Phi tại Đại học Malaya) xác nhận cả dòng A1-H.1 và dòng UM01 đều phụ thuộc DARC khi xâm nhập các normocytes ở người, mặc dù ghi nhận đôi chút thay đổi đối với dòng UM01. Vì không có sẵn máu của khỉ đuôi dài M. fascicularis âm tính DARC, chúng tôi đã sử dụng hai kháng thể nhắm vào các axit amin khác nhau của vùng DARC đầu N (anti-Fybvà MAb Fy6). Như dự kiến, các kháng thể nhắm vào vùng Fy6 hoàn toàn triệt tiêu sự xâm nhập các normocyte người của dòng A1-H.1 và về căn bản cũng như vậy đối với dòng UM01. Tuy nhiên, các kháng thể anti-Fy6 chỉ gây ra ức chế nhỏ đối với sự xâm nhập các normocyte khỉ của cả hai dòng UM01 và A1-H.1. Kháng thể anti-Fybtạo ra sự ức chế thấp đối với sự xâm nhập tế bào hồng cầu người bởi hai dòng và sự ức chế này rất khác nhau đối với sự xâm nhập tế bào hồng cầu khỉ bởi cả hai dòng ký sinh trùng (Hình 4).

Bàn luận

Trong điều kiện thực nghiệm, một điều khá phổ biến là một loài Plasmodium sp. cụ thể thường gây nhiễm cho các loài vật chủ hơn là những ký chủ tự nhiên. Sự truyền bệnh giữa các loài vật chủ có xương sống thường dẫn đến những thay đổi của quá trình lây nhiễm đặc trưng. Những thay đổi tương tự cũng đã được ghi nhận đối với các ký sinh trùng được duy trì thực nghiệm bằng đường máu hay trong các vật chủ bị cắt bỏ lách. Những thay đổi này (có thể liên quan đến hình thái học, sự kết dính tế bào, độc lực, tích chất lây truyền) nhấn mạnh tính linh hoạt sinh học của ký sinh trùng sốt rét. Cơ sở cho sự biến đổi kiểu hình như thế vẫn còn chưa được biết đến và có thể là do ký chủ hoặc các yếu tố ký sinh trùng hoặc cả hai, kể cả các thuộc tính tế bào hồng cầu hoặc biểu hiện thay đổi của các protein ký sinh trùng.

H5

Việc phân lập một dòng P.knowlesi mới từ một bệnh nhân đã mang đến một cơ hội để so sánh các đặc điểm xâm nhập của nó với các đặc tính từ một dòng vô tính thích nghi với nuôi cấy trong tế bào hồng cầu người mà đã thu được tương tự vào năm 1963. Các so sánh sánh cặp đôi trong các xét nghiệm xâm nhập các tế bào hồng cầu người và khỉ đuôi dài M. fascicularis chỉ ra rằng hai dòng này không có sự khác biệt đáng kể về khả năng hay ái tính với vật chủ. Trong cả hai trường hợp, sự ưa thích đối với hồng cầu lưới thì ít tuyệt đối hơn nhiều so với sự ưa thích quan sát được ở P. vivax đối với hồng cầu lưới người. Các dòng ký sinh trùng UM01 và dòng A1-H.1 rõ ràng là phụ thuộc nhiều vào sự hiện diện của DARC trên các tế bào hồng cầu người, với đôi chút thay đổi quan sát được đối với dòng UM01. Các dữ liệu từ các kháng thể đơn dòng chống lại DARC không cho phép diễn giải rõ ràng. Loài khỉ cùng với nhiều loài động vật linh trưởng khác (ngoại trừ người) thì âm tính Fyavới kiểu hình Fybdễ biến đổi.

H6

Điều này có thể giải thích cho sự biến đổi lớn trong ức chế sự xâm nhập các tế bào hồng cầu khỉ có sự hiện diện của kháng thể anti-Fyb(Hình 4). Như vậy, có khả năng là P. knowlesi có thể xâm nhập các tế bào hồng cầu vật chủ khỉ của nó theo một lối không phụ thuộc DARC, do vậy khẳng định các quan sát nghiên cứu trước đó là đúng.

H7

Hình 1. Phân lập, nhân rộng P. knowlesi, dòng UM01. Dòng UM01 được phân lập từ một bệnh nhân sốt rét nhiễm P. knowlesi và nhân rộng bằng cách tiêm truyền nó qua khỉ đuôi dài M. fascicularis (khỉ A, B, C và D). Các giai đoạn thể nhẫn của dòng UM01 thu được từ quá trình nhân rộng được trữ lạnh cho đến khi sử dụng tiếp. Các ký sinh trùng thu được từ hoặc sự trưởng thành invivo hoặc sự trưởng thành ex vivo được sử dụng cho các thí nghiệm xâm nhập và ức chế.

Hai sự khác biệt được ghi nhận trong quá trình quan sát hai dòng này. Thứ nhất, thời gian của chu kỳ trong hồng cầu đối với dòng UM01 nhân lên vô tính luôn ngắn hơn so với dòng A1-H.1 và thứ hai, dường như kém sản sinh giao bào ở dòng A1-H.1. Có khả năng rằng những khác biệt này là do các giai đoạn dài nuôi cấy invitro kéo dài cần thiết để làm cho dòng A1-H.1 thích ứng với các tế bào hồng cầu người. Việc diễn giải những quan sát của các nhà nghiên cứu sẽ tính đến khả năng rằng dòng UM01 có thể không vô tính và có thể chứa nhiều hơn một kiểu gen ký sinh trùng.

Các quan sát trình bày ở đây có thể chỉ được xem như là những biểu hiện ban đầu của sự đa dạng kiểu hình tiềm năng của ký sinh trùng P. knowlesi. Loài này phân bố khắp các nước Đông Nam Á trong các khu vực riêng biệt về mặt địa lý, một vài trong số đó là những hòn đảo. Những khác biệt được lưu ý đối với các thể phân lập khác nhau đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu sốt rét phân loại một số trong những loài này thành những loài phụ khác biệt. Quan điểm này được chứng minh bởi các phân tích phân tử gần đây về các ký sinh trùng từ Borneo, nơi hai quần thể khác biệt về mặt di truyềnđã được xác định. Vì vậy, điều quan trọng là thiết lập và mô tả các dòng P. knowlesi từ mỗi khu vực địa lý nơi ký sinh trùng này xuất hiện để đảm bảo sự phù hợp của các phân tích so sánh trong tương lai nhằm làm sáng tỏ cơ chế sinh học hoặc sinh lý bệnh học. Rốt cuộc thì việc dựa vào một hoặc hai chủng P. knowlesi đã được cấy truyền qua vô số các loài động vật trên 50-80 năm qua có thể hạn chế đáng kể sự hiểu biết của chúng ta về các quần thể P. knowlesi đương đại đang đe dọa sức khỏe con người ngày nay.

H8

Hình 2. Các nghiên cứu xâm nhập với P. knowlesi. Sự xâm nhập của P. knowlesi (chủng UM01 và A1-H.1) ở hồng cầu bình thường (normocyte) và hồng cầu lưới (reticulocyte) khỉ và người; các đoạn ngang = các giá trị trung bình (màu đen cho dòng UM01 và màu đỏ trong dòng A1-H.1). Tác động của các loài mang hồng cầu (người với khỉ) và tuổi hồng cầu (hồng cầu thường với hồng cầu lưới) được so sánh bằng cách sử dụng phân tích ANOVA.

Bảng 1. Mật độ KST P. knowlesi giai đoạn vô tính và hữu tính (chủng UM01 và A1-H.1) với tỷ lệ chuyển đổi giao bào từ nuôi cấy ex vivo/in vitro trong hồng cầu bình thường của khỉ.

Phương pháp

Khía cạnh y đức

Chấp thuận y đức cho các quy trình thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu đối với máu người và khỉ này đã đạt được và thông qua bởi Hội đồng Y đức Trung tâm y tế Đại học Malaya (Số tham chiếu MEC: 817,18) và Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng động vật Đại học Malaya (số tham chiếu Y đức: PAR/19/02/2013/AA (R) và PAR/6/03/2015/AA(R). Tất cả các thí nghiệm sử dụng vật mẫu người và khỉ được thực hiện theo các hướng dẫn và quy định đã được phê duyệt; Văn bản đồng ý tham gia đều có chữ ký tất cả các đối tượng tham gia là con người.

Thu thập mẫu

Các mẫu máu từ các bệnh nhân nhập viện tại Trung tâm y tế đại học Malaya nghi ngờ mắc sốt rét được chứa trong các ống nghiệm 5 mL có chất chống đông (heparin + lithium) rồi gửi đến labo Ký sinh trùng Chẩn đoán Đông Nam châu Á để chẩn đoán sốt rét. Việc chẩn đoán nhiễm P. knowlesi và mật độ ký sinh trùng P. knowlesi được xác định bằng xét nghiệm kính hiển vi các lam máu nhuộm Giemsa và được khẳng định bởi các xét nghiệm sinh học phân tử Nested-PCR đặc trưng loài Plasmodium sp. Sau khi loại bỏ huyết tương, tiểu cầu và bạch cầu đã được gỡ ra khỏi các thể phân lập dương tính P. knowlesi bằng cột CF11(Whatman) trước bảo quản lạnh dịch lọc.

Hình 3. Các lam máu UM01 nhuộm Giemsa cho thấy các giao bào (mũi tên đỏ) được quan sát thấy ở những ngày nuôi cấy khác nhau.

Hình 4. Mô tả sự phụ thuộc DARC của các thể hoa thị P. knowlesi đối với sự xâm nhập các hồng cầu bình thường của người và khỉ. Sự ức chế xâm nhập của P. knowlesi (dòng UM01 và A1-H.1) vào các tế bào hồng cầu bình thường ở người và khỉ bằng MAb Fy6 và anti-Fyb(máu người âm tính Duffy được sử dụng như chứng dương). Các đoạn ngang hiển thị tỷ lệ phần trăm mức độ ức chế trung bình được chuẩn hóa đối với nhóm chứng Ab-free của mỗi thí nghiệm độc lập cho dòng UM01. Hiệu quả của MAb Fy6 và anti-Fyb trong ức chế xâm nhập ở cả máu người và khỉ được so sánh bằng cách sử dụng phân tích ANOVA.

Tách chiết DNA và xét nghiệm Nested-PCR lồng:

DNA của ký sinh trùng được tách chiết từ ​​100 μL mẫu máu toàn phần của bệnh nhân sử dụng bộ kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Valencia, CA, USA) như hướng dẫn của nhà sản xuất. Kỹ thuật Nested-PCR được thực hiện trên DNA được tách chiết để khuếch đại các chuỗi đặc hiệu loài của các tiểu đơn vị nhỏ của ribosome RNA (rRNA 18S SSU) của Plasmodium sp. sử dụng các cặp mồi hay đoạn mồi được phát triển trước đây. Trong phản ứng Nested-PCR đầu tiên, 5 pmoles của các đoạn mồi đặc hiệu giống được sử dụng: (rPLU1: 5 '-TCA AAG ATT AAG CCA TGC AAG TGA-3' và rPLU5: 5'-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TCC-3 '). Một lượng gồm 21 μL hỗn hợp PCR (0.25MdNTP,1unit Taqpolymerase,1× dung dịch đệm PCR (35 mM Tris-HCl [pH 9.0], 3,5 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 0,01% gelatin) và 15,3 μL dung dịch có nuclease tự do (nuclease- free water) được thêm vào 4 μL DNA.

Quá trình khuếch đại chính được thực hiện theo các điều kiện chu kỳ nhiệt sau đây: 94°C trong 4 phút, 35 vòng ở 94°C trong 30 giây, 55°C trong 1 phút và ở 72°C trong 1 phút, cuối cùng là giai đoạn kéo dài mạch ở 72°C trong 10 phút. Trong các quá trình khuếch đại phụ tiếp theo, 5 pmoles của các đoạn mồi đặc hiệu loài được sử dụng:

FAL1: 5'-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3'và FAL2: 5'-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC -3 'cho P. falciparum,

VIV1: 5'-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3' và V1V2: 5'-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3 'cho P. vivax;

OVAL1: 5'-ATC TCT TTT GCT ATC TTT TTT TAG TAT TGG AGA- 3 'và OVAL2: 5'-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3' cho P. ovale;

MAL1: 5'-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3 'và MAL2: 5'-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA- 3' cho P. malariae;

Pmk8: 5'-GTT AGC AGC GAG CAC AAA AAA GCG AAT- 3 'và Pmkr9: 5'-ACT CAA AGT AAC AAA ATC TTC CGT A-3' cho P. knowlesi.

Đối với mỗi khuếch đại phụ, 4 μL sản phẩm khuếch đại chính được sử dụng trong phản ứng PCR (như trên) để làm thành tổng lượng phản ứng là 25 μL. Kỹ thuật PCR được thực hiện theo các điều kiện sau đây: 94°C trong 4 phút, 35 vòng ở 94°C trong 30 s, 58°C trong 1 phút và ở 72°C trong 1 phút, cuối cùng là giai đoạn kéo dài mạch ở 72°C trong 10 phút. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện chuyển sử dụng gel agarose 2%.

Giữ đông ký sinh trùng và rã đông ký sinh trùng

Các phân lập P. knowlesi dương tính được đông lạnh trong Glycerolyte 57 (Baxter, Bỉ). Dùng hai thể tích Glycerolyte 57 cho một thể tích các hồng cầu được gây nhiễm để đông lạnh ký sinh trùng. Đầu tiên, thêm nhỏ giọt 20% lượng Glycerolyte 57 vào dung dịch huyền phù hồng cầu bị nhiễm bệnh trong khi liên tục lắc ống để trộn các hỗn hợp. Sau đó để yên ống trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trước khi đổ phần còn lại của Glycerolyte 57 vào. Dung dịch pha chế này được trích vào các tube lạnh chuyên dụng (cryovial) và được lưu trữ trong một thùng nitơ lỏng.

H9

Khi đã sẵn sàng sử dụng, một ống cryovial đông lạnh được lấy ra khỏi thùng chứa nitơ lỏng và cho rã đông trong một bình nước 37°C. Khi đã rã đông, tiến hành đo thể tích máu trong ống cryovial và chuyển sang một ống falcon 50 ml. Thêm nhỏ giọt 0,2 × lượng NaCl 12% vào và để yên ống trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm nhỏ giọt 10 ×lượng NaCl 1,6%. Ống này sau đó được cho ly tâm (380 × g, 5 phút) và gạn bỏ phần dịch nổi. Tiếp theo, thêm nhỏ giọt 10 × lượng NaCl 0,9%, sau đó ly tâm một đợt nữa (380 × g, 5 phút). Phần dịch nổi lại được gạn bỏ và các viên pellet tế bào hồng cầu gây nhiễm được tái huyền phù trong môi trường RPMI 1640 được làm ấm đến 37°C và sau đó được sử dụng cho thử nghiệm in vivo hoặc thử nghiệm ex vivo.

Quy trình gây nhiễm động vật:

Bốn con khỉ chưa bị gây nhiễm sốt rét (M. fascicularis) được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các con khỉ được gây giống và nuôi ở các cơ sở chăn nuôi trong môi trường không có sốt rét tại Việt Nam (Nafovanny) và khi sử dụng khỉ đã được 2 tuổi và cân nặng từ 2 kg. Các con khỉ này được nhốt trong lồng cá nhân và nuôi bằng các viên thức ăn thương mại dành cho động vật linh trưởng không phải con người được bổ sung nhiều loại trái cây tươi.

Khoảng 4.106ký sinh trùng chủng P. knowlesi UM01 rã đông được huyền phù trong PBS được tiêm vào tĩnh mạch khỉ A. Thu thập cách nhật trong máu ngoại vi để theo dõi sự xuất hiện các ký sinh trùng. Một khi phát hiện được một ký sinh trùng bằng kính hiển vi, tiến hành lấy lam máu hàng ngày để theo dõi sự tiến triển của ký sinh trùng và diễn biến bệnh. Các lam máu được nhuộm với giêm sa 10%. Vào ngày thứ 8 sau khi gây nhiễm tỷ lệ ký sinh trùng đạt 2,6% quan sát thấy chủ yếu là các thể tư dưỡng già. Tổng cộng 2 mL máu toàn phần được lấy từ khỉ bị nhiễm bệnh và ký sinh trùng được để cho trưởng thành trong thử nghiệm ex vivo trong 15 giờ để chúng phát triển thành các thể phân liệt mà sau đó vỡ ra để giải phóng merozoites xâm chiếm các tế bào hồng cầu tươi. Điều này dẫn đến sự gia tăng gấp đôi mật độ ký sinh trùng và sản sinh các giai đoạn thể nhẫn cần thiết để bảo quản lạnh như mô tả ở trên.

Giữa giai đoạn một và hai tháng sau, cấy máu khỉ nhiễm bệnh đông lạnh vào ba con khỉ đuôi dài M. fascicularis chưa mắc sốt rét (khỉ B, C và D) bằng phương pháp tương tự như trên. Khi mật độ ký sinh trùng đạt 1% hoặc hơn, lấy 2-4 mL máu hoặc để bảo quản lạnh hoặc để sử dụng trong các thử nghiệm xâm nhập ex-vivo. Khỉ bị nhiễm bệnh được điều trị bằng cách cho uống 25 mg/kg mefloquine tám ngày sau khi gây nhiễm.

Thử nghiệm phát triển ký sinh trùng trên ex vivo:

Khoảng 2-4 mL máu trước xử lý được thu thập từ khỉ bị gây nhiễm cho vào ống heparin. Các hồng cầu đông đặc được phục hồi bằng cách ly tâm (380 × g trong 5 phút) và sau đó được tái huyền phù trong môi trường nuôi cấy (môi trường RPMI1640 được bổ sung 2,5 g/L D-glucose, 25mM HEPES và 20% v/v huyết thanh AB người bất hoạt nhiệt) thành dung tích hồng cầu xấp xỉ 3% và nuôi cấy ở 37°C trong các bình chứa hỗn hợp khí gồm 90%N2,5%O2và5%CO2.Quá trình phát triển và nhân lên của ký sinh trùng được theo dõi bằng cách soi lam máu mỏng nhuộm Giemsa dưới kính hiển vi. Sự phát triển vô tính của các dòng UM01 được theo dõi tại giờ 0, giờ thứ 4, 10, 22 và 24 của quá trình nuôi cấy.

H10

Việc đếm các giai đoạn sinh sản hữu tính và vô tính được xác định bằng ký sinh trùng được nuôi cấy ngoài cơ thể trong một vài ngày. Các ký sinh trùng A1-H.1 được nuôi cấy tại một thời điểm khác nhau có mật độ ký sinh trùng tương tự được dùng làm đối chứng. Ít nhất 500 tế bào nhiễm bệnh được đếm để tính toán tỷ lệ chuyển đổi giao bào.

Nuôi cấy in vitro các chủng A1-H.1:

Tiến hành rã đông một mẫu A1-H.1 đông lạnh, đo dung tích và chuyển sang một ống Falcon 15 mL, thêm vào nhỏ giọt lượng tương tự NaCl 3,5%. Sau đó ly tâm hỗn hợp ở 380 × g trong 5 phút và gạn bỏ phần dịch nổi. Thêm lần nữa lượng NaCl 3,5% tương tự và ly tâm mẫu thí nghiệm giống như trên và gạn bỏ phần dịch nổi đi. Bước này được lặp lại một lần nữa. Các viên pellet cuối cùng được tái huyền phù thành thể tích hồng cầu đặc 2% trong môi trườngRPMI1640 điều chỉnh làm ấm trước bổ sung 10% huyết thanh ngựa như mô tả. Dung dịch huyền phù được nuôi cấy ở 37°C trong các bình chứa hỗn hợp khí gồm 90%N2,5%O2và5%CO2. Môi trường được thay đổi từng ngày.

Quá trình nhân lên và các giai đoạn phát triển ký sinh trùng được theo dõi bằng xét nghiệm các phim máu giọt mỏng nhuộm Giêm sa. Hai ngày trước khi làm các xét nghiệm xâm nhập, môi trường nuôi cấy được thay đổi thành môi trường RPMI1640 bổ sung 2,5 g/L D-glucose, 25mM HEPES và 20% huyết thanh AB người bất hoạt nhiệt, tương tự như môi trường được sử dụng trong thử nghiệm sự phát triển ký sinh trùng ex vivo như mô tả ở trên.

Tinh sạch thể phân liệt:

Kỹ thuật tách từ trường MACS được sử dụng để làm sạch phân liệt cho thấy các cột MACS^® (25 LD colums, Miltenyi Biotec, Đức) được giữ nhờ chất có từ trường Quadro MACS^® được rót đầy môi trường RPMI1640 làm ấm trước (37°C). Máu từ nuôi cấy P.knowlesi ex vivo hoặc từ khỉ nhiễm bệnh được pha loãng với môi trường RPMI 1640 để đạt được thể tích hồng cầu đặc 50% và đọng lại trên đầu cột MACS^®.

Khi máu đã đi qua cột, môi trường được bổ sung thêm cho đến khi chất rửa không còn các tế bào hồng cầu. Sau đó cột được gỡ bỏ vùng từ trường và 2 mL môi trường để rửa giải thể phân liệt. Chất rửa giải được ly tâm (380 × g, 10 phút) và viên pellet giàu thể phân liệt được sử dụng cho các xét nghiệm xâm nhập. Mật độ ký sinh trùng được xác định bằng xét nghiệm các lam máu nhuộm Giêmsa dưới kính hiển vi.

H11

Chuẩn bị xét nghiệm máu và làm giàu hồng cầu lưới:

Lấy máu từ tĩnh mạch 5 mL máu của những người hiến máu khỏe mạnh có nhóm máu O hoặc từ khỉ khỏe mạnh vào ống có chứa sẵn lithium heparin. Phân loại nhóm máu hệ ABO được thực hiện bằng cách sử dụng chất phản ứng anti-A và anti-B (Bio-Rad, USA) theo quy trình của nhà sản xuất. Để phân loại kháng nguyên Duffy, sử dụng huyết thanh anti-Fyavà anti-Fyb(Lorne Laboratories). Gỡ bỏ huyết tương và rửa phân số máu còn lại ba lần với môi trường RPMI 1640 và cuối cùng điều chỉnh thành thể tích huyết cầu 50% bằng môi trường RPMI1640 và cất giữ ở 4°C. Máu được sử dụng cho việc thử nghiệm xâm nhập trong vòng 1 tháng chuẩn bị.

Để làm giàu hồng cầu lưới, các tế bào máu đỏ đông đặc được rửa trong môi trường RPMI 1640 và các bạch cầu và tiểu cầu được làm tan bằng 2 vòng lọc cột CF11 (Whatman). Sau đó các khối tế bào máu phục hồi được điều chỉnh thành thể tích hồng cầu đặc 50% bằng môi trường RPMI 1640 và hỗn hợp được chia thành các aliquot 5 mL được xếp lớp cẩn thận trên 6mL70% dung dịch isotonic percollcushion. Sau khi ly tâm trong 15 phút ở 1200 g, kết quả dải mịn hồng cầu lưới cô đặc hình thành trên bề mặt percoll được lấy ra cẩn thận và rửa hai lần trong môi trường RPMI 1640. Các dung dịch hồng cầu lưới cô đặc được rửa sạch được bảo quản ở 4°C trong môi trường RPMI 1640 ở thể tích huyết cầu 20% và được sử dụng cho các xét nghiệm xâm nhập trong vòng 1 tháng chuẩn bị.

Trước khi sử dụng, tỷ lệ hồng cầu lưới được xác định bằng cách nhuộm tươi với màu xanh metylen mới.

Kháng thể:

Kháng thể đơn dòng FY6 nhận ra biểu vị 2C3 trên vùng cuối N DARC nằm trên màng bề mặt hồng cầu đã được tác giả Yves Colin Aronovicz và Olivier S. Bertrand đang làm việc đại học Paris Diderot, Pháp cung cấp và các kháng thể Anti-Fyb (EP2546Y) được mua từ Abcam, Mỹ.

Xét nghiệm xâm nhập:

Dung dịch thể phân liệt tinh khiết được trộn với các huyết cầu đích (nghĩa là hồng cầu bình thường hoặc hồng cầu lưới của người, hồng cầu bình thường hoặc hồng cầu lưới khỉ) sao cho mật độ ký sinh trùng phân liệt khởi đầu không quá 12%. Hỗn hợp được pha loãng đến thể tích hồng cầu đặc 4% bằng môi trường RPMI 1640 hoàn toàn, và chuẩn bị các aliquot khác nhau. Sau đó các kháng thể Fy6 Mab hoặc anti Fyb được thêm vào một trong các aliquot (hoặc không thêm đối với đối chứng) ở nồng độ cuối cùng tương ứng là 25μg/mLvà20μg/mL. Các aliquote 100μL của mỗi hỗn hợp sau đó được phân bố trong một đĩa 96 giếng và cung cấp hỗn hợp khí gồm 90%N2,5%O2,và5%CO2. Các mẻ nuôi cấy sau đó được ủ trong một lồng ấp ở 37,5°C trong khoảng trung bình 15 giờ, có thể kéo dài đến 20 giờ tùy thuộc vào giai đoạn trưởng thành của ký sinh trùng, để cho sự tái xâm nhập xảy ra. Việc lặp lại kỹ thuật được thực hiện cho mỗi thí nghiệm khi đã có đủ vật liệu phân liệt. Các lam máu mỏng được lấy từ mỗi giếng vào cuối giai đoạn ủ và số thể nhẫn/ thể tư dưỡng trong 4.000 hồng cầu được tính bằng cách soi lam máu giọt mỏng nhuộm giêm sa dưới kính hiển vi quang học.

Phân tích thống kê:

Phân tích phương sai ANOVA và so sánh nhiều nhóm bằng phương pháp Tukeyđược thực hiện bằng GraphPad Prism phiên bản 5.00 dành cho Windows, GraphPad Software, San Diego California USA.

Tài liệu tham khảo

1.Sinton,J.A.&Mulligan,H.W.Acriticalreviewoftheliteraturerelatingtotheidentificationofthemalarialparasitesrecorded from monkeysofthefamiliesCercopithecidæandColobidæ.RecMalariaSurvIndia3,357–380(1932).

2.Garnham,P.C.C.InMalariaparasites andotherhaemosporidiaCh.13,323–356(BlackwellScientificPublications,1966).

3.Collins,W.E.InMalaria.PrinciplesandpracticeofmalariologyVol.II (edsWaltherHWernsdorfer&IanAMcGregor)Ch.48, 1473–1501(ChurchillLivingstone,1988).

4.Knowles,R.&DasGupta,B.M.Astudyofmonkey-malaria,anditsexperimentaltransmissiontoman. (Apreliminaryreport).IndMedGaz67,301–320(1932).

5.Ciuca,M.InActaConventusTertiideTropicisAtqueMalariaeMorbisVol.ParsII.ActaConventusTertiideMalariaeMorbis327–345 (Spin,C.A.&Zoon,N.V.Amsterdam,Amsterdam,1938).

6.Milam,D.F.& Kusch,E.ObservationsonPlasmodiumknowlesi malariaingeneralparesis.SouthMedJ31,947–949(1938).

7.Wharton,R.H.& Eyles,D.E.Anopheleshackeri,avectorofPlasmodiumknowlesiinMalaya.Science134,279–280(1961).

8.Singh,B.etal.Alargefocusofnaturallyacquired Plasmodiumknowlesi infectionsinhumanbeings.Lancet363,1017–1024(2004).

9.Singh,B.&Daneshvar,C.HumaninfectionsanddetectionofPlasmodiumknowlesi.ClinMicrobiol Rev26,165–184(2013).

10.Brown,K.N.&Brown,I.N.Immunitytomalaria:antigenicvariationin chronicinfectionsofPlasmodiumknowlesi.Nature208, 1286–1288(1965).

11.Dvorak,J.A., Miller,L.H.,Whitehouse, W.C.&Shiroishi, T.Invasionoferythrocytesbymalariamerozoites.Science187,748–750 (1975).

12.Miller,L.H.,Mason,S.J.,Dvorak,J.A.,McGinniss,M.H.&Rothman,I.K.Erythrocytereceptorsfor(Plasmodium knowlesi) malaria:Duffybloodgroupdeterminants.Science189,561–563(1975).

13.Kocken,C.H.M.etal.Plasmodiumknowlesi providesarapidinvitroandinvivotransfectionsystemthatenablesdouble-crossover geneknockoutstudies.InfectImmun70,655–660(2002).

14.Grüring,C.etal.Humanredbloodcell-adaptedPlasmodiumknowlesiparasites:anewmodelsystemfor malariaresearch.Cell Microbiol16,612–620,doi:10.1111/cmi.12275(2014).

15.Moon,R.W.etal.Adaptationofthegeneticallytractablemalaria pathogenPlasmodiumknowlesitocontinuouscultureinhuman erythrocytes.ProcNatl AcadSciUSA110,531–536(2013).

16.Chitnis,C.E.&Miller,L.H.IdentificationoftheerythrocytebindingdomainsofPlasmodiumvivaxandPlasmodiumknowlesi proteinsinvolvedinerythrocyteinvasion.JExpMed180,497–506(1994).

17.Chitnis,C.E.,Chaudhuri,A.,Horuk,R.,Pogo,A.O. &Miller,L.H.ThedomainontheDuffybloodgroupantigenforbinding PlasmodiumvivaxandP.knowlesimalarialparasitestoerythrocytes.JExpMed184,1531–1536(1996).

18.Demogines,A.,Truong,K.A.&Sawyer,S.L.Species-specific featuresofDARC,theprimatereceptorforPlasmodiumvivaxand Plasmodiumknowlesi.MolBiolEvol29,445–449(2012).

19.Malleret,B.etal.Plasmodiumvivax:restrictedtropismandrapidremodeling ofCD71-positivereticulocytes.Blood125,1314–1324 (2015).

20.Palatnik,M.&Rowe,A.W.DuffyandDuffy-relatedhumanantigensin primates. JHumEvol13,173–179(1984).

21.Mason, S.J.,Miller,L.H.,Shiroishi,T.,Dvorak,J.A.&McGinniss,M.H.TheDuffybloodgroupdeterminants:theirrole inthesusceptibilityofhumanandanimal erythrocytesto Plasmodiumknowlesi malaria.BrJHaematol36,327–335(1977).

22.Siddiqui,W.A.,Schnell,J.V.&Richmond-Crum,S.M.Susceptibilityofanewworldmonkey (Aotustrivirgatus)toanoldworldsimianmalarialparasite(Plasmodiumknowlesi).TransRSocTropMedHyg68,387–391(1974).

23.Collins,W.E.,Contacos,P.G.&Chin,W.InfectionofthesquirrelmonkeySaimirisciureus,withPlasmodiumknowlesi.TransRSoc TropMedHyg72,662–663(1978).

24.Langhorne,J.&Cohen,S.Plasmodiumknowlesi inthemarmoset(Callithrixjacchus).Parasitology78,67–76(1979).

25.Pinheiro,M.M.etal.Plasmodiumknowlesigenome sequencesfromclinicalisolatesrevealextensivegenomicdimorphism.Plos One10,e0121303(2015).

26.Divis,P.C.etal.Admixturein humansoftwodivergentPlasmodiumknowlesipopulationsassociatedwithdifferentmacaquehost species.PLosPathog11,e1004888(2015).

27.Assefa,S.etal.PopulationgenomicstructureandadaptationinthezoonoticmalariaparasitePlasmodiumknowlesi.ProcNatlAcadSciUSA112,13027-13032(2015).

28.Sriprawat,K. etal.EffectiveandcheapremovalofleukocytesandplateletsfromPlasmodiumvivaxinfectedblood.MalarJ8,115 (2009).

29.Singh,B.etal.Agenus-and species-specificnestedpolymerasechainreaction malariadetection assayforepidemiologicstudies.Am JTropMedHyg60,687–692(1999).

30.Borlon,C.etal.CryopreservedPlasmodiumvivaxandcordbloodreticulocytes canbeusedforinvasionandshorttermculture.IntJParasitol42,155–160(2012).

Các nội dung khác »

---

• Sốt rét do Plasmodium vivax: Thách thức tiềm tàng đe doạ lộ trình loại trừ & tiêu diệt sốt rét (Phần 5 và Hết) (23/04/2024)
• Sốt rét do Plasmodium vivax: Thách thức tiềm tàng đe doạ lộ trình loại trừ & tiêu diệt sốt rét (Phần 4) (22/04/2024)
• Sốt rét do Plasmodium vivax: Thách thức tiềm tàng đe doạ lộ trình loại trừ & tiêu diệt sốt rét (Phần 3) (19/04/2024)
• Sốt rét do Plasmodium vivax: Thách thức tiềm tàng đe doạ lộ trình loại trừ & tiêu diệt sốt rét (Phần 2) (15/04/2024)
• Sốt rét do Plasmodium vivax: Thách thức tiềm tàng đe doạ lộ trình loại trừ & tiêu diệt sốt rét (Phần 1) (09/04/2024)
• Ký sinh trùng sốt rét kháng artemisinin tại Châu Phi đầu tiên đang có nguy cơ đe dọa thành quả phòng chống sốt rét toàn cầu (20/10/2023)
• Cập nhật đặc điểm phân bố và bệnh học của 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh ở người (09/06/2023)
• Thông tin cập nhật về sốt rét Plasmodium vivax_Phần 2 (12/05/2023)
• Thông tin cập nhật về sốt rét Plasmodium vivax_Phần 1 (11/05/2023)
• Phần 3.Thêm bằng chứng về thuốc Tafenoquine (Krintafel®, Arakoda®, Kozenis®) góp phần thúc đẫy loại trừ sốt rét Plasmodium vivax và Plasmodium ovale (06/02/2023)
• Phần 2. Thêm bằng chứng về thuốc Tafenoquine (Krintafel®, Arakoda®, Kozenis®) góp phần thúc đẫy loại trừ sốt rét Plasmodium vivax và Plasmodium ovale (03/02/2023)
• Phần 1. Thêm bằng chứng về thuốc Tafenoquine (Krintafel®, Arakoda®, Kozenis®) góp phần thúc đẫy loại trừ sốt rét Plasmodium vivax và Plasmodium ovale (02/02/2023)
• TGA Úc phê duyệt sử dụng thuốc Kozenis (tafenoquine) liều đơn điều trị sốt rét cho trẻ em nhiễm Plasmodium vivax (07/04/2022)
• Phần 2: Cập nhật thông tin về hiệu lực thuốc sốt rét artesunate-mefloquine trong điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum đa kháng thuốc (02/08/2019)
• Phần 1. Cập nhật thông tin về hiệu lực thuốc sốt rét artesunate-mefloquine trong điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum đa kháng thuốc (30/07/2019)